【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测试剂盒领域，具体涉及一种检测游离dna样本中人类红细胞rhd基因的引物组、试剂盒及其用途。
技术介绍
1、胎儿新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，hdfn）在我国以母婴abo血型系统不合为主，rh血型系统相关hdfn占1.91%，但rh血型d抗原是引起中等和严重程度的hdfn的最常见原因。当rhd阴性母亲妊娠rhd阳性胎儿时,胎儿的d抗原刺激母体产生抗-d抗体，该抗体与胎儿d抗原结合造成hdfn。目前对于产生抗d的rhd阴性孕妇，临床给予注射抗d免疫球蛋白封闭来自胎儿的rhd阳性的红细胞，预防hdfn。通过检测孕妇外周血中游离的胎儿dna，可对rhd阴性孕妇胎儿的rhd血型进行无创产前检测，为临床诊断提供参考。现有的游离dna样本中人类红细胞rhd基因检测试剂会出现假阳性、假阴性等问题，这是由引物设计、孔位设计、内标选择、反应条件选择、质量控制方法等多方面原因造成的。
技术实现思路
1、本专利技术采用实时荧光pcr结合taqman探针技术对人类rhd基因第5，7，10外显子进行检测。依据ncbi上的rhd基因序列设计特异性引物及探针引物，探针引物为5’端报告基团和3’淬灭基团的寡核苷酸。在pcr扩增过程中，探针引物的结合位置位于上下游特异性引物之间，并先于特异性引物结合在模板上，当扩增延伸到探针结合的位置时，taq酶的5'外切酶活性会将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检
2、本专利技术的试剂盒用于rhd阴性（rhd全基因缺失，rhd-ce(2-9)-d和dva(hus)）孕妇外周血胎儿游离dna的rhd血型基因分型检测，包括rhd基因的第5，7，10外显子，可以对母胎rhd血型不合导致的胎儿新生儿溶血病进行辅助诊断。
3、本专利技术引物组的设计依据美国国家生物技术信息中心（ncbi）建立的dna序列数据库（genbank）中公开的人类基因序列，针对rhd相关基因突变或缺失等信息设计特异引物和探针引物；内标引物组设计依据ncbi数据库公开的基因序列信息，根据人类基因的保守区域设计。
4、检测游离dna样本中人类红细胞rhd基因的引物组的序列如seq id no.1-9所示，其中：第一组引物如序列seq id no.1-3所示，检测rhd基因中第5外显子的信息，其中seqid no.3是探针引物；第二组引物如序列seq id no.4-6所示，检测rhd基因中第7外显子的信息，其中seq id no.6是探针引物；第三组引物如序列seq id no.7-9所示，检测rhd基因中第10外显子的信息，其中seq id no.9是探针引物。
5、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，上述每一组引物分别处于不同的反应容器内。
6、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，还包含内标引物组1，其序列如seq id no.10-12所示，检测人类praf2基因的信息，其中seq id no.12是探针引物。
7、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，还包含内标引物组2，其序列如seq id no.13-15所示，检测人类maged1基因的信息，其中seq id no.15是探针引物。
8、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，还包含内标引物组3，其序列如seq id no.16-18所示，检测人类sry基因的信息，其中seq id no.18是探针引物。
9、上述内标引物组1可以与每一组引物组处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。内标引物组1可以单独处于反应容器内，检测内标基因的信息。内标引物组2可以与内标引物组1处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。内标引物组3可以与内标引物组1、内标引物组2处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。
10、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，还包含由23%的10×pcr buffer、45%的gcbuffer、18%的浓度为2.5mm的dntp、2%的浓度为5u/μl的dna聚合酶及12%的水等组分构成的浓缩反应液。
11、进一步的，在本专利技术的试剂盒中，探针引物seq id no.3的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团mgb。探针引物seq id no.6的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团bhq3。探针引物seq id no.9的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团bhq3。探针引物seq id no.12的5’端标记荧光基团hex，3’端标记淬灭基团mgb。探针引物seq id no.15的5’端标记荧光基团texas red，3’端标记淬灭基团bhq2。探针引物seq id no.18的5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团bhq3。
12、进一步的，本专利技术的试剂盒可以用于非诊断性游离dna样本中人类红细胞rhd基因检测。
13、该试剂盒的使用方法为如下顺序的步骤：
14、（1）根据实验所需数量取出冷冻的试剂，放置室温解冻备用（注意避光）；引物板可用壁纸刀裁剪相应数量孔位。特别提示：不可破坏反应孔完整及孔边缘平滑性。引物板需避光放置；
15、（2）观察pcr板包被的引物及浓缩反应液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色方可使用，pcr板包被的引物均于板底存在，否则失效不能使用；
16、（3）工作反应液配制：取出所需的dna，将28μl的dna与20μl的浓缩反应液混合后震荡混匀，800rpm离心数秒，使混合液全部置于管底，制成工作反应液；
17、（4）撕掉引物板上透明封板膜，放置于水平桌面洁净位置，根据孔位布局图，向对应的孔中各加入10μl工作反应液。加样时加样枪头抵在反应孔的内侧壁，不能触及底部包被的引物。加样后用板式离心机瞬时离心或手工轻甩使混合液滑至管底部，不可剧烈摇动防止液体溅出；
18、（5）使用推荐封膜机及铝膜热封反应板顶部，反应孔应完全被封闭。封膜机推荐条件：175℃，4.5s；或滴管加入25±10μl石蜡油蜡封，然后将封板膜重新覆上引物板。封膜处可做样本顺序标记；
19、（6）将密封后的工作引物板放入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，设置各孔所需的荧光信号及pcr采集荧光信号的时机，在96℃进行2分钟的预变性，然后进行15个循环的96℃20秒和68℃50秒的反应，然后进行5个循环的96℃20秒和65℃50秒的反应，然后进行22个循环的96℃20秒和62℃50秒的反应；
20、（7）游离总dna有效性的判定：根据各检测孔中检测人类praf2基因的探针的hex荧光信号和检测人类maged1基因的探针的rox荧光信号进行判定。如果hex荧光信号的ct值≤31，且rox荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测游离DNA样本中人类红细胞RHD基因的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID No.1-9所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组对应的检测位点分别为：第一组引物如序列SEQ ID No.1-3所示，检测RHD基因中第5外显子的信息，其中SEQ ID No.3是探针引物，其5’端标记荧光基团CY5，3’端标记淬灭基团MGB；第二组引物如序列SEQ IDNo.4-6所示，检测RHD基因中第7外显子的信息，其中SEQ ID No.6是探针引物，其5’端标记荧光基团CY5，3’端标记淬灭基团BHQ3；第三组引物如序列SEQ ID No.7-9所示，检测RHD基因中第10外显子的信息，其中SEQ ID No.9是探针引物，其5’端标记荧光基团CY5，3’端标记淬灭基团BHQ3。
3.一种检测游离DNA样本中人类红细胞RHD基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组，每一组引物分别处于不同的反应容器内。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含内标引物组1、内标引物组2和内标引物组3。内标
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标引物组1既可以单独处于反应容器内，也可以与SEQ ID No.1-9中每一组引物组处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标引物组2可以与内标引物组1处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标引物组3可以与内标引物组1、内标引物组2处于相同的反应容器内，检测内标基因的信息。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括浓缩反应液。浓缩反应液由23%的10×PCR buffer、45%的GC buffer、18%的浓度为2.5mM的dNTP、2%的浓度为5U/μl的DNA聚合酶及12%的水等组分构成。
9.权利要求4所述的试剂盒在非诊断性游离DNA样本中人类红细胞RHD基因检测中的用途。
10.一种如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种检测游离dna样本中人类红细胞rhd基因的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如seq id no.1-9所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组对应的检测位点分别为：第一组引物如序列seq id no.1-3所示，检测rhd基因中第5外显子的信息，其中seq id no.3是探针引物，其5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团mgb；第二组引物如序列seq idno.4-6所示，检测rhd基因中第7外显子的信息，其中seq id no.6是探针引物，其5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团bhq3；第三组引物如序列seq id no.7-9所示，检测rhd基因中第10外显子的信息，其中seq id no.9是探针引物，其5’端标记荧光基团cy5，3’端标记淬灭基团bhq3。
3.一种检测游离dna样本中人类红细胞rhd基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组，每一组引物分别处于不同的反应容器内。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含内标引物组1、内标引物组2和内标引物组3。内标引物组1的序列如seq id no.10-12所示，检测人类praf2基因的信息，其中seq id no.12是探针引物，其5’端标记荧光基团hex，3’端标记淬灭基团mgb。内标引物组2的序列如seq id no.13-15所示，检...
【专利技术属性】
技术研发人员：李劲松，
申请(专利权)人：天津市秀鹏生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。