【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体是涉及烟草轻型绿花叶病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法。
技术介绍
1、地黄rehmannia glutinosa l.为玄参科(scrophulariaceae)地黄属(rehmannia)，多年生草本植物，其新鲜或干燥块根入药即为中药地黄，具有滋阴、延缓衰老和抗肿瘤等多种药用功效。地黄主要以其块根进行营养繁殖，在长期的无性繁殖中易造成病毒病的发生，导致地黄产量降低和种性退化，严重影响地黄的产量和品质。tmgmv属于烟草花叶病毒属(tobamovirus)，最早在烟草上发现，tmgmv可通过机械摩擦传毒，感染tmgmv后引起叶片褪绿、花叶、扭曲变形。目前主要侵染茄科、夹竹桃科、凤仙花科等多种植物。
2、针对tmgmv的检测技术主要有rt-pcr结合核苷酸序列测定、实时rt-pcr、酶联免疫吸附测定(elisa)、双抗体夹心酶联免疫吸附法(das-elisa)，这些方法存在灵敏度低、特异差、耗时长、仪器昂贵和操作复杂等缺点。2000年，notomi等建立的环介导等温核酸扩增(loop mediated isothermal amplification，lamp)技术，可在恒温(60～65℃)条件下利用dna链置换聚合酶，快速对靶基因进行扩增的新型分子检测技术，目前已被应用于多种植物病毒的检测，其优点是简单、快速及检测结果可视化。
3、因此，如何将lamp技术应用于tmgmv检测，建立一种比常规pcr方法更具优势的检测技术，以适用于基层和田间病毒检测的需求，是需要解决的技
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种烟草轻型绿花叶病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、1.检测烟草轻型绿花叶病毒的rt-lamp引物组：包括一对外引物、一对内引物和一条环引物组成的引物组，具体如下：
4、(1)一对外引物：tmgmv-f3：5’-gcttatgcagatcctgtgc-3’；
5、tmgmv-b3:5’-gctatttaataacgccgtgat-3’；
6、(2)一对内引物：tmgmv-fip：5’
7、-tgttggactgttgtcctagcttgtgtacaaatgcattgggt-3’；
8、tmgmv-bip：5’
9、-cctggaaacctgtgcctagtatgcggatcaagcgtcgaatt-3’；
10、(3)一条环引物：tmgmv-lb：5’-acagtgagatttcctgcatcgg-3’。
11、2.rt-lamp引物组检测烟草轻型绿花叶病毒的方法，包括以下步骤：
12、(1)病毒总rna的提取及cdna的合成：按照柱式植物总rna提取试剂盒说明书的要求提取叶片的总rna，按照primescripttmⅱ1st strand cdna synthesis kit反转录成合成cdna；
13、(2)rt-lamp扩增：以合成的cdna为模板，进行rt-lamp扩增反应；
14、(3)rt-lamp扩增反应结束后，短暂离心，甩下盖内核酸染料，若溶液呈现绿色则判断为阳性，若溶液出现橙色则判断为阴性；
15、或者，取rt-lamp产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析，若出现瀑布状条带则判断为阳性，无条带则判断为阴性。
16、优选的rt-lamp扩增的反应体系为：模板1μl、1×thermopol buffer、tmgmv-fip和tmgmv-bip引物各1.6μmol/l；tmgmv-f3和tmgmv-b3引物各0.2μmol/l、tmgmv-lb引物0.4μmol/l、mg2+6mm、dntps 1.4mm、bst dna polymerase 8u，ddh2o补足25μl；反应时将反应体系加入pcr管中，用移液枪轻轻吸打混匀后，加入30μl石蜡油进行封存，在pcr管盖内加入0.5μl sybr green i染色剂。
17、优选的的rt-lamp扩增的反应条件为：65℃反应60min，85℃反应5min，冰上终止反应。
18、3.rt-lamp引物组在制备地黄花叶病毒检测试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术的有益效果：
19、1.本专利技术通过对rt-lamp检测引物的筛选和反应条件的优化，建立一种灵敏度高的tmgmv检测方法，结果表明，该方法可以检测到1.65×10-2个拷贝/μl的病毒，其灵敏度是常规pcr的1000倍，灵敏度较高。
20、2.特异性试验表明，本专利技术的方法对地黄的tmgmv、yomv、bbwv-2、remv、clvd和ccyv等六种rna病毒检测，只有tmgmv检测出阳性，表明本专利技术方法具有很好的特异性。
21、3.本专利技术对rt-lamp扩增反应温度和时间进行优化，结果表明rt-lamp扩增反应的温度为65℃时得到的凝胶电泳条带最亮，60min为最佳反应时间。
22、4.田间检测应用试验表明，本专利技术的rt-lamp检测的准确率高于普通pcr，可应用于地黄田间样品的检测。
23、5.本专利技术的tmgmv环介导恒温快速扩增方法，通过加入sybr green i核酸染料实现可视化检测，直接观察检测结果，操作简单，为tmgmv田间检测提供了一种方便、快捷的方法。
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1.检测烟草轻型绿花叶病毒的RT-LAMP引物组，其特征是：包括一对外引物、一对内引物和一条环引物组成的引物组，具体如下：
2.一种利用权利要求1所述的RT-LAMP引物组检测烟草轻型绿花叶病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的RT-LAMP扩增的反应体系为：模板1μL、1×ThermoPol Buffer、TMGMV-FIP和TMGMV-BIP引物各1.6μmol/L；TMGMV-F3和TMGMV-B3引物各0.2μmol/L、TMGMV-LB引物0.4μmol/L、Mg2+6mM、dNTPs 1.4mM、Bst DNA polymerase8U，ddH2O补足25μL；反应时将反应体系加入PCR管中，用移液枪轻轻吸打混匀后，加入30μL石蜡油进行封存，在PCR管盖内加入0.5μL SYBR Green I染色剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的RT-LAMP扩增的反应条件为：65℃反应60min，85℃反应5min，冰上终止反应。
5.一种权利要求1所述的RT-
...【技术特征摘要】
1.检测烟草轻型绿花叶病毒的rt-lamp引物组，其特征是：包括一对外引物、一对内引物和一条环引物组成的引物组，具体如下：
2.一种利用权利要求1所述的rt-lamp引物组检测烟草轻型绿花叶病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的rt-lamp扩增的反应体系为：模板1μl、1×thermopol buffer、tmgmv-fip和tmgmv-bip引物各1.6μmol/l；tmgmv-f3和tmgmv-b3引物各0.2μmol/l、tmgmv-lb引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦艳红，鲁书豪，王飞，李绍建，高素霞，文艺，杨瑾，李雪梦，鲁传涛，张德胜，郝学政，刘永康，李明杰，古力，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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