【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和基因工程疫苗，更具体地说，涉及一种能够同时表达猪瘟病毒e2基因和il18基因的prrsv病毒重组质粒和基因工程疫苗。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)是一种严重影响全球养猪业的病毒性传染病，其病因为prrs病毒(prrsv)。prrsv是一种单股正链rna病毒，属于套式病毒目、动脉炎病毒科。prrsv的基因组编码了多种结构蛋白和非结构蛋白。prrsv是一种重要的病原体，在作为病毒活载体上，其基因组具有一定的可塑性，适合用作反向遗传工具来插入外源基因。该病毒的基因组约为15kb，其中包含适合替换或插入外源基因的区域。基因组中的部分orfs存在重叠序列，而其他orfs之间则有明确的间隔，为外源基因的插入提供了优选的位置。这些特性使得通过这些区域插入外源基因所构建的重组病毒，在基因表达和生物学特性上与其亲本病毒没有显著差异。高飞等在高致病性(highly-pathogenic)prrsv弱毒疫苗株(vhun4-f112)的基因组orf1b和orf2a中插入猪瘟病毒的e2基因，另外，在e2基因3'端添加了prrsv的转录调控序列6(trs6)，让e2作为新的亚基因组进行后续的转录表达，以此构建了全长感染性克隆质粒pprrsv-e2，经过marc-145上的转染和拯救，获得了重组病毒rprrsv-e2株，该重组病毒能够表达猪瘟病毒的e2基因，重组病毒rprrsv-e2也与亲本病毒vhu-n4-f112的生长特性相似。
2、il-18作为一种具有强烈生物活
3、当前，猪繁殖与呼吸综合征(prrs)的疫苗技术面临诸多挑战，其中包括复杂的注射程序和需分两次注射的限制。这不仅增加了养猪场操作的复杂性，还影响了疫苗的普及和使用效果。此外，现有疫苗的稳定性和剂量计算的准确性问题，进一步限制了它们在实际应用中的效果和可靠性。与传统疫苗相比，本申请提出的技术方案具备明显的优势。该方案通过一次性注射含有e2和il-18基因的质粒，即pegfp-il18-orf6，实现了对猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟两种病毒的同时防控。e2作为猪繁殖与呼吸综合征的重要抗原和il-18作为免疫增强剂的联合应用，有望展现出协同效应，促进t淋巴细胞的增殖并显著提升关键免疫细胞因子如ifn-γ及il-2的产生。
4、尽管目前缺乏直接的实验数据来证明这种协同作用的具体效果，但从理论上推测，这种双重基因疫苗策略可能在提升免疫效果和疫苗稳定性方面带来显著优势。因此，本申请不仅专注于解决现有疫苗技术的局限性，还致力于开发出一种更为便捷、更稳定且效果更显著的疫苗方案，为全球养猪业提供可靠的保护措施和创新解决方案。
技术实现思路
1、为了提供一种更有效的疫苗，本专利技术的目的在于，首先提供一种同时表达猪瘟病毒e2基因和il18基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗。
2、其中所述的同时表达猪瘟病毒e2基因和il18基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗为rprrsv-e2-n-il18-y，所述重组活载体疫苗是能够稳定同时表达猪瘟病毒e2蛋白和il18蛋白的高致病性prrsv细胞传代致弱株hun4-f112重组重组弱毒疫苗株，上述重组活载体疫苗是由重组质粒pprrsv-e2-n-il18-y转染marc-145细胞后拯救得到，pprrsv-e2-n-il18-y的全长为17767bp，其中第1-9999位序列如seq id no.1所示，第10000-17767bp如序列如seq id no.2所示。
3、进一步的，本专利技术提供一种同时可表达猪瘟病毒e2蛋白和il18蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗的制备方法，所述方法按以下步骤进行：(1)制苗用细胞的传代与培养：将marc-145细胞经过edta-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，备用；(2)细胞种毒的繁殖：将病毒液按1/10的体积量接入已经生长良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获后的毒液冻融2～3次后置于-15℃以下保存，取少量做半成品检验；(3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液与常规稳定剂按1︰1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于105.0tcid50，分装后进行冷冻干燥即得成品，其中，病毒液由重组质粒pprrsv-e2-n-il18-y转染marc-145细胞后拯救得到。
4、进一步的，本申请提供一种同时可表达猪瘟病毒e2蛋白和il18蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒，所述重组质粒为pprrsv-e2-n-il18-y，其全长为17767bp，其中第1-9999位序列如seq id no.1所示，第10000-17767bp如序列如seq id no.2所示。
5、进一步的，本申请提供一种同时表达猪瘟病毒e2基因和il18基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组重组质粒的方法，为根据猪源il18基因合成含有il18基因以及相关酶切位点序列的质粒，在pprrsv-e2的orf7和3'utr之间插入il18基因，并在外源基因3'端下游插入prrsv的转录调控序列6(trs6)。将扩增出的含有il18基因的质粒通过swa i和mlu i双酶切，然后回收pcr产物，利用t4 dna连接酶连接到pprrsv-e2的swa i和mlu i双酶切载体上，从而获得了重组重组质粒，所述重组重组质粒为pprrsv-e2-n-il18-y。
6、进一步的，本申请提供一种上述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗和\或所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒在制备治疗和\或猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。
7、进一步的，本申请提供一种组合物，其中包含上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗和\或猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒。
8、有益效果
9、本专利技术提供的重组质粒pprrsv-e2-n-il18-y，经转染marc-145细胞并成功拯救出的病毒，展现出与亲本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗嵌合表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒E2蛋白。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，所述重组活载体疫苗为rPRRSV-E2-N-IL18-Y，是由重组质粒pPRRSV-E2-N-IL18-Y转染MARC-145细胞后拯救得到。
3.如权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，其中，pPRRSV-E2-N-IL18-Y的全长为17767bp，其中第1-9999位序列如SEQ ID NO.1所示，第10000-17767bp如序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒嵌合表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒E2蛋白。
5.如权利要求4所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒为pPRRSV-E2-N-IL18-Y，其全长为17767bp，其中第1-9999位序列如SEQ ID NO.1所示，第1
6.一种表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒E2蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法为利用T4 DNA连接制备嵌合重组质粒，根据IL18基因合成含有IL18基因以及相关酶切位点序列的质粒，经过双酶切处理好，在pPRRSV-E2的ORF7和3'UTR之间插入IL18基因，并在外源基因3'端下游插入PRRSV的转录调控序列6(TRS6)；将扩增出的含有IL18基因的质粒通过Swa I和Mlu I双酶切，然后回收PCR产物连接到pPRRSV-E2的Swa I和Mlu I双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒，所述嵌合重组质粒为pPRRSV-E2-N-IL18-Y。
7.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗的制备方法，所述方法按以下步骤进行：(1)制苗用细胞的传代与培养：将MARC-145细胞经过EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，备用；(2)细胞种毒的繁殖：将病毒液按1/10的体积量接入已经生长良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获后的毒液冻融2～3次后置于-15℃以下保存，取少量做半成品检验；(3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液与常规稳定剂按1︰1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于105.0TCID50，分装后进行冷冻干燥即得成品；所述病毒液的制备方法为：将pPRRSV-E2-N-IL18-Y质粒Swa I线性化；体外转录；RNA的转染；待出现细胞病变后，收取上清并传代获得病毒rPRRSV-E2-N-IL18-Y。
8.一种利用权利要求7所述的制备方法获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗。
9.权利要求1-3或8之一所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗和\或权利要求4或5所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒在制备治疗和\或猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于权利要求1-3或8之一所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗和\或权利要求4或5所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒。
...【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗嵌合表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒e2蛋白。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，所述重组活载体疫苗为rprrsv-e2-n-il18-y，是由重组质粒pprrsv-e2-n-il18-y转染marc-145细胞后拯救得到。
3.如权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组活载体疫苗，其中，pprrsv-e2-n-il18-y的全长为17767bp，其中第1-9999位序列如seq id no.1所示，第10000-17767bp如序列如seq id no.2所示。
4.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒嵌合表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒e2蛋白。
5.如权利要求4所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒为pprrsv-e2-n-il18-y，其全长为17767bp，其中第1-9999位序列如seq id no.1所示，第10000-17767bp如序列如seq id no.2所示。
6.一种表达猪源白介素18基因和猪瘟病毒e2蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法为利用t4 dna连接制备嵌合重组质粒，根据il18基因合成含有il18基因以及相关酶切位点序列的质粒，经过双酶切处理好，在pprrsv-e2的orf7和3'utr之间插入il18基因，并在外源基因3'端下游插入prrsv的转录调控序列6(trs6)；将扩增出的含有il18基因的质粒通过s...
【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，郭子强，童光志，周艳君，李丽薇，姜一峰，童武，刘长龙，郑浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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