【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物定量分析领域，具体涉及一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法。
技术介绍
1、dna的5位碳原子发生甲基化修饰，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)是重要的表观遗传机制作，同时也是表观遗传学的热点研究内容，在胚胎发育、细胞分化、基因调控和转录等方面发挥重要作用。近年来，人们发现dna甲基化参与哺乳动物的多种生物过程，包括干细胞多能性、发育、衰老和肿瘤发生，此外还调控了基因的表达。人体健康的生长发育依赖于正常的甲基化水平，而异常的甲基化表达通常与疾病的发生密切相关，比如癌症和神经紊乱性等相关疾病。因此，定量分析不同细胞、组织或临床样品中5mc的含量，不仅对明确生物体在发育过程和稳态发挥重要作用，而且在辅助临床诊断方面也具有重大意义。
2、dna甲基化是一种动态可逆的过程，基因组中的5mc可被体内的双加氧酶(tets)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，随后被tet蛋白进一步氧化为5-甲酰胞嘧啶(5fc)和5-羧基胞嘧啶(5cac)，最后通过剪辑切除修复途径恢复为正常的胞嘧啶。作为5mc的氧化产物，5hmc、5fc和5cac在哺乳动物基因组中的丰度远低于5mc(比5mc低10至100倍)。研究发现5hmc在癌细胞的基因组中呈现出低表达，同时与基因的激活有关。因此，发展一种同时检测5mc和5hmc的分析方法在研究基因表达和辅助临床诊断方面具有重要意义和价值。
3、由于结构的相似性和低丰度使得这些甲基化修饰的鉴定和定量成为巨大的挑战。当前，5mc及其氧化产物的检测方法主要依赖液
技术实现思路
1、为克服常规核酸甲基化检测方法依赖精密控温大型仪器、对序列依赖性强、所需样品用量大的不足，本专利技术提供一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，能够在温和条件下即可实现全基因组dna 5mc和5hmc简单、快速、灵敏的检测目的，且无需依靠大型仪器，具有检测样品用量少、简单经济的优势。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，包括如下步骤：
4、从生物样品中提取dna，该dna含有5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰位点，设计合成含有内剪切酶识别序列的发夹探针；
5、将dna经过氧化、重亚硫酸盐处理或只经过重亚硫酸盐处理，将非甲基化dna经过重亚硫酸盐处理；分别配置一系列由不同比例的处理后的甲基化dna与处理后的非甲基化dna组成的甲基化组；取处理后的非甲基化dna作为非甲基化组；
6、将甲基化组和非甲基化组分别在tdt酶的作用下进行无模板延伸，然后与发夹探针进行杂交，再加入t4 dna连接酶进行连接，然后在扩增反应体系的作用下进行延伸、剪切、扩增，并将荧光基团带入扩增后产物，检测甲基化组和非甲基化组的荧光强度；
7、计算甲基化组与未甲基化组荧光强度的差值，以该差值为纵坐标，并以甲基化组中的甲基化dna的占比为横坐标，建立检测标准曲线；
8、将该检测标准曲线用于检测待测样品的5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰水平。
9、进一步的，从生物样品中提取的dna首先经过片段化处理，形成具有3'-oh末端的结构。
10、进一步的，该分析方法中，氧化处理采用tci氧化剂。
11、进一步的，甲基化组和非甲基化组在与发夹探针进行杂交之前，分别在tdt酶的作用下进行无模板延伸。
12、进一步的，在tdt酶的作用下进行无模板延伸的过程为：以3'-oh端为引物，dna在tdt酶的作用下进行无模板延伸，形成poly-t序列，含有内剪切酶识别序列的poly-a发夹结构能够与poly-t序列进行互补。
13、进一步的，所述扩增反应体系包括klenow dna聚合酶、datp、dttp、dctp、荧光基团标记的gtp、nt.bsmai剪切酶。
14、进一步的，nt.bsmai剪切酶的浓度为0.6u，klenow dna聚合酶的反应浓度为0.07u，datp、dttp、dctp、荧光基团标记的gtp的浓度分别为150μm。
15、进一步的，荧光检测针对的是525nm处波长。
16、进一步的，所述检测标准曲线包括两种，一种检测标准曲线对应的是5-甲基胞嘧啶修饰水平，另一种检测标准曲线对应的是5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶总修饰水平。
17、进一步的，应用获得的标准曲线针对待测样品进行5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰水平分析的过程为：
18、从待测样品中提取dna，全基因组dna含有5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰位点，设计合成含有内剪切酶识别序列的发夹探针；
19、将提取的dna经过氧化、重亚硫酸盐处理或只经过重亚硫酸盐处理，作为测试组，将非甲基化dna经过重亚硫酸盐处理，作为空白组；将测试组和空白组分别在tdt酶的作用下进行无模板延伸，然后与发夹探针进行杂交，再加入t4 dna连接酶进行连接，然后在扩增反应体系的作用下进行延伸、剪切、扩增，并将荧光基团带入扩增后产物，检测测试组和空白组的荧光强度；
20、计算测试组与空白组荧光强度的差值，将该差值代入建立的检测标准曲线，获得待测样品的5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰水平。
21、本专利技术的有益效果是：
22、本专利技术利用nt.bsmai剪切酶对核苷酸位点的识别和切割能力，与模板dna中的5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶信号能够特异性地转化为互补链中荧光标记的gtp的荧光信号，结合核酸恒温扩增反应，从而构建一种信号放大策略并基于甲基化与未甲基化荧光强度的差值构建检测标准曲线，以实现对表观遗传修饰物全基因组5mc、5hmc的检测。
23、本专利技术的方法具有以下特点：
24、1、可同时实现对全基因组5mc和5hmc的检测；
25、2、无需依靠大型仪器，常见的加热装置即可完成反应，具有简单经济的优势。
26、3、检测样品用量少，反应用量约为70ng；
27、4、无复杂的引物设计；
28、5、实现对临床样本的检测，可应用于癌症早筛；
29、6、单一荧光检测，无荧光基团间干扰；
30、7、检测准确可信，不会产生实时荧光检测假阳性；
31、8、不受序列依赖性。
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1.一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，从生物样品中提取的DNA首先经过片段化处理，形成具有3'-OH末端的结构。
3.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，氧化处理采用TCI氧化剂。
4.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，甲基化组和非甲基化组在与发夹探针进行杂交之前，分别在TdT酶的作用下进行无模板延伸。
5.根据权利要求4所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，在TdT酶的作用下进行无模板延伸的过程为：以3'-OH端为引物，DNA在TdT酶的作用下进行无模板延伸，形成Poly-T序列，含有内剪切酶识别序列的Poly-A发夹结构能够与Poly-T序列进行互补。
6.根据权利要求1所述的一种可同时定
7.根据权利要求6所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，Nt.BsmAI剪切酶的浓度为0.6U，Klenow DNA聚合酶的反应浓度为0.07U，dATP、dTTP、dCTP、荧光基团标记的GTP的浓度分别为150μM。
8.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，荧光检测针对的是525nm处波长。
9.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，所述检测标准曲线包括两种，一种检测标准曲线对应的是5-甲基胞嘧啶修饰水平，另一种检测标准曲线对应的是5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶总修饰水平。
10.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，应用获得的标准曲线针对待测样品进行5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰水平分析的过程为：
...【技术特征摘要】
1.一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，从生物样品中提取的dna首先经过片段化处理，形成具有3'-oh末端的结构。
3.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，氧化处理采用tci氧化剂。
4.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，甲基化组和非甲基化组在与发夹探针进行杂交之前，分别在tdt酶的作用下进行无模板延伸。
5.根据权利要求4所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析方法，其特征在于，在tdt酶的作用下进行无模板延伸的过程为：以3'-oh端为引物，dna在tdt酶的作用下进行无模板延伸，形成poly-t序列，含有内剪切酶识别序列的poly-a发夹结构能够与poly-t序列进行互补。
6.根据权利要求1所述的一种可同时定量全基因组5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹萍，张凤，李帼膺，王婉雪，刘延琼，马海欧，周怡，舒瑶瑶，陈佳怡，龚昌凯，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：
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