【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体地涉及一种同时检测多种呼吸道病原体的方法及试剂盒。
技术介绍
1、呼吸道感染是世界范围的常见病，也是全球范围内引起人群发病的最主要原因之一。呼吸道感染是由多种微生物包括细菌、病毒、支原体、真菌、寄生虫等引起的感染性疾病。通常会引起婴幼儿，老人及免疫受损病人严重的上下呼吸道感染，导致哮喘、细支气管炎、肺炎等疾病，而且极易引起流行或爆发，具有很高的发病率。
2、链式聚合酶反应(pcr)常用于对病菌的基因的脱氧核糖核酸(dna)进行检测与鉴定。目前已开发了一些检测方法和试剂盒用于检测呼吸道菌感染。然而，大多数检测方法和和试剂盒是仅针对一种、两种或三种病原体，无法对于多种病原体的检测，尤其缺乏对导致肺炎的呼吸道感染病原体(如金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌)简便快捷的检测方法。
3、基于此，本领域迫切需要开发简便快捷的、高通量地检测针对多种呼吸道病原体的方法和试剂盒。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种简便快捷的、高通量地检测多种呼吸道病原体的方法和试剂盒。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种聚合酶链式反应方法，所述方法包括步骤：
3、(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性同时扩增至少6种呼吸道病原体的核酸片段的特异性引物对，其中所述的呼吸道病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜
4、所述6种呼吸道病原体的核酸片段分别为如seq id nos：1～6所示的核苷酸序列；并且
5、所述特异性引物对包括：seq id no.：7所示核苷酸序列的上游引物和seq idno.：8所示核苷酸序列的下游引物；seq id no.：9所示核苷酸序列的上游引物和seq idno.：10所示核苷酸序列的下游引物；seq id no.：11所示核苷酸序列的上游引物和seq idno.：12所示核苷酸序列的下游引物；或seq id no.：1 3所示核苷酸序列的上游引物和seqid no.：14所示核苷酸序列的下游引物。
6、在另一优选例中，所述的特异性引物对包括：seq id no.：9所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：1 0所示核苷酸序列的下游引物。
7、在另一优选例中，还包括步骤：
8、(b)对步骤(a)获得的扩增产物用呼吸道病原体的特异性探针进行检测。
9、在另一优选例中，所述的特异性探针包括检测探针。
10、在另一优选例中，所述检测探针与步骤(a)所述的扩增产物特异性杂交。
11、在另一优选例中，所述检测探针具有选自seq id nos：21～26所示的核苷酸序列。
12、在另一优选例中，所述的检测探针带有可检测标记。
13、在另一优选例中，所述的可检测标记包括：荧光团、荧光微球。
14、在另一优选例中，所述检测试剂还包括捕获探针。
15、在另一优选例中，所述捕获探针与步骤(a)所述的扩增产物特异性杂交。
16、在另一优选例中，所述捕获探针具有如下所示的核苷酸序列：
17、如seq id no.：15所示，捕获如seq id no.：1所示的核酸片段；
18、如seq id no.：16所示，捕获如seq id no.：2所示的核酸片段；
19、如seq id no.：17所示，捕获如seq id no.：3所示的核酸片段；
20、如seq id no.：18所示，捕获如seq id no.：4所示的核酸片段；
21、如seq id no.：19所示，捕获如seq id no.：5所示的核酸片段；
22、如seq id no.：20所示，捕获如seq id no.：6所示的核酸片段。
23、在另一优选例中，所述捕获探针固定于固体支持物。
24、在另一优选例中，所述固体支持物选自纤维素膜、尼龙膜、化学激活膜、磁珠和微孔板。
25、本专利技术的第二方面，提供了一种六病原体通用引物对，所述的引物对包括：
26、seq id no.：7所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：8所示核苷酸序列的下游引物；seq id no.：9所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：10所示核苷酸序列的下游引物；seq id no.：11所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：12所示核苷酸序列的下游引物；或seq id no.：13所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：14所示核苷酸序列的下游引物。
27、在另一优选例中，所述的六病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
28、在另一优选例中，所述的引物对包括：seq id no.：9所示核苷酸序列的上游引物和seq id no.：10所示核苷酸序列的下游引物。
29、本专利技术的第三方面，提供了本专利技术的第二方面所述的引物对的用途，用于制备同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒。
30、在另一优选例中，所述的6种呼吸道病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
31、本专利技术的第四方面，提供了一种检测试剂，其包括：
32、a.六病原体通用引物对；
33、b.核酸探针。
34、在另一优选例中，所述的六病原体包括金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
35、在另一优选例中，所述通用引物对具有如seq id no.：9和seq id no.：10所示的核苷酸序列。
36、在另一优选例中，所述的核酸探针包括捕获探针和检测探针。
37、本专利技术的第五方面，提供了一种试剂盒，包括：第一容器以及位于所述容器内扩增呼吸道病原体如本专利技术的第二方面所述的引物对。
38、在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
39、在另一优选例中，所述的核酸探针是针对选自下组的呼吸道病原体的特异性探针：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
40、在另一优选例中，所述捕获探针与步骤(a)所述的扩增产物特异性杂交。
41、在另一优选例中，所述检测探针与步骤(a)所述的扩增产物特异性杂交。
42、在另一优选例中，所述捕获探针具有如下所示的核苷酸序列：
43、如seq id no.：15所示，捕获如seq id no.：1所示的核酸片段；
44、如seq id no.：16所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
3.一种六病原体通用引物对，其特征在于，所述的引物对包括：
4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述的六病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
5.如权利要求4所述的引物对的用途，其特征在于，用于制备同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒；所述的6种呼吸道病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
6.一种检测试剂，其特征在于，其包括：
7.如权利要求6所述的检测试剂，其特征在于，所述通用引物对具有如SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的核苷酸序列。
8.一种试剂盒，其特征在于，其包括：第一容器以及位于所述容器内扩增呼吸道病原体的如权利要求3所述的引物对。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核
10.如权利要求6所述的检测试剂或如权利要求8所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于体外非诊断地检测样品中是否存在呼吸道病原体。
...【技术特征摘要】
1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
3.一种六病原体通用引物对，其特征在于，所述的引物对包括：
4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述的六病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
5.如权利要求4所述的引物对的用途，其特征在于，用于制备同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒；所述的6种呼吸道病原体选自：金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、嗜血流感杆菌。
【专利技术属性】
技术研发人员：李佳，梁玉婷，王娟，陈雯静，汤荣，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：
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