【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及乳糖二岩藻四糖(ldft)的制造方法。
技术介绍
1、认为人母乳中所含的寡糖(hmo)在益生元效果、婴幼儿的肠道环境和免疫功能的调节、感染防御、以及认知功能发育等方面有用(非专利文献1)。
2、乳糖二岩藻四糖(以下称为ldft。)为hmo的1种，为在乳糖的半乳糖2位和葡萄糖3位分别以α1,2键或α1,3键键合有岩藻糖的4糖型岩藻糖基化寡糖。是兼具同样作为岩藻糖基化寡糖而已知的2’-岩藻糖基乳糖(以下称为2’fl。)和3-岩藻糖基乳糖(以下称为3fl。)的结构的hmo。
3、据报道，在人母乳中，从初乳向成熟乳的过渡乳中含有约0.5g/l的ldft(非专利文献2)。作为ldft的功能性，已知对b族链球菌具有强抗菌作用等(非专利文献3)，但功能性研究仍处于发展过程中。
4、作为ldft的制造方法，使用表达岩藻糖基转移酶的微生物的以乳糖为底物的微生物发酵法广为人知。据报道，该微生物发酵法中，单独使用α1,2-岩藻糖基转移酶或组合使用α1,2-岩藻糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶来作为岩藻糖基转移酶，由此可以高效地生产ldft(专利文献1、2、非专利文献4)。
5、作为上述微生物发酵法中单独使用的α1,2-岩藻糖基转移酶，可列举例如来自幽门螺杆菌(helicobacter pylori)的futc(专利文献1)。
6、上述微生物发酵法中组合使用α1,2-岩藻糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶时，作为α1,2-岩藻糖基转移酶，可列举例如来自大肠杆菌o126(es
7、上述微生物发酵法中组合使用α1,2-岩藻糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶时，作为α1,3-岩藻糖基转移酶，可列举例如来自脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)的cafa、来自北拟杆菌(bacteroides nordii)的cafc、来自嗜粘蛋白阿克曼菌(akkermansiamuciniphila)的caff(均参见专利文献2)或来自幽门螺杆菌ua948(helicobacter pyloriua948)的hp3/4ft(非专利文献4)等。
8、非专利文献4公开了如下工艺：使用不能利用ldft的中间体3fl作为底物的、特异性地以乳糖为底物的α1,2-岩藻糖基转移酶wbgl和以2’fl为底物的α1,3-岩藻糖基转移酶hp3/4ft，由乳糖经由2’fl通过单一流程生产ldft。
9、现有技术文献
10、专利文献
11、专利文献1：国际公开第2015/032413号
12、专利文献2：日本特表2017-527311号公报
13、非专利文献
14、非专利文献1：trends in food science&technology, 118(2021)374-387
15、非专利文献2：nutrients,2021,13(8)2737
16、非专利文献3：accounts of chemical research,2019,52(3)760-768
17、非专利文献4：metabolic engineering,66(2021)12-20
技术实现思路
1、专利技术所要解决的问题
2、但是，上述非专利文献4记载的方法存在如下课题：hp3/4ft也与乳糖反应而较多地蓄积作为副产物的3fl，另外hp3/4ft向ldft的转化活性不充分，因此2’fl作为副产物而残存。
3、为了更高效地制造ldft，需要探索能够将作为中间体的2’fl或3fl与乳糖同样地识别为底物且能够将2’fl或3fl高效且快速地转化为ldft的α1,2-岩藻糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶。
4、因此，本专利技术的目的在于，提供ldft的生产率优良的微生物。
5、用于解决问题的方法
6、本专利技术人们发现，由特定的氨基酸序列构成的蛋白质的活性得到增强的微生物与亲株相比，ldft的生产率提高，从而完成了本专利技术。
7、即，本专利技术如下所述。
8、1. 一种微生物，其中，下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质和下述[4]～[6]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强，并且与亲株相比乳糖二岩藻四糖(ldft)的生产率提高。
9、[1]由序列号8所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
10、[2]由在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白。
11、[3]由与序列号8所示的氨基酸序列具有80%以上的一致性的氨基酸序列构成并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。
12、[4]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
13、[5]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成并且具有α1,3-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白。
14、[6]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上的一致性的氨基酸序列构成并且具有α1,3-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。
15、2. 一种ldft的制造方法，其包括制备上述1所述的微生物的步骤、以及使用该微生物在培养物中生成ldft的步骤。
16、3. 一种由培养上述1所述的微生物而得到的培养物制造ldft的晶体的方法，其包括下述(i)～(iii)的步骤。
17、(i)对上述培养物进行离心分离而得到除去了菌体的上清的步骤
18、(ii)对步骤(i)中得到的上清进行阳离子交换和阴离子交换而得到从上清中除去了离子的溶液的步骤
19、(iii)由步骤(ii)中得到的溶液得到ldft的晶体的步骤
20、专利技术效果
21、本专利技术的微生物的由特定的氨基酸序列构成的两种蛋白质的活性得到增强。这两种蛋白质中的一种能够将作为ldft的中间体的3fl与乳糖同样地识别为底物，具有能够将3fl高效且快速地转化为ldft的α1,2-岩藻糖基转移酶活性。另外，这两种蛋白质中的另一种能够将作为ldft的中间体的2’fl与乳糖同样地识别为底物，具有能够将2’fl高效且快速地转化为ldft的α1,3-岩藻糖基转移酶活性。通过增强这两种蛋白质的活性，本专利技术的微生物可抑制作为中间体的2’fl和3fl以副产物形式残存、提高ldft的生产率。
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1.一种微生物，其中，下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质和下述[4]～[6]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强，并且与亲株相比乳糖二岩藻四糖(LDFT)的生产率提高，
2.一种LDFT的制造方法，其包括制备权利要求1所述的微生物的步骤、以及使用该微生物在培养物中生成LDFT的步骤。
3.一种由培养权利要求1所述的微生物而得到的培养物制造LDFT的晶体的方法，其包括下述(i)～(iii)的步骤：
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种微生物，其中，下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质和下述[4]～[6]中任一项记载的蛋白质的活性得到增强，并且与亲株相比乳糖二岩藻四糖(ldft)的生产率提高，
2.一种ldft的制造方法，...
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