【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞冻存，具体涉及一种无dmso的细胞冻存液及其应用。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是一种多能干细胞，具有自我更新的能力，能够大量扩增，并且在特定条件下可以分化形成多种终末组织细胞，如神经细胞、视网膜细胞、肝脏细胞、胃肠组织、脂肪组织、肌肉血管、血液、皮肤毛发、骨骼和软骨细胞等。人们最早从骨髓中分离得到mscs，后来发现肝脏、皮肤、肌肉、软骨及外周血等多种组织中也有少数mscs存在。mscs具有支持造血、调节免疫功能、促进损伤组织修复和防治移植物抗宿主病等作用，已成为再生医学和组织工程学领域的重要种子细胞与潜在治疗工具。目前，在广泛的临床和科学研究中，扩增使用后的间充质干细胞有时需要被冻存起来，其目的是在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命，以备用于科研及临床随时复苏使用，此过程常采用的方法是在间充质干细胞的冻存中需要加入冻存保护液，然后经过程序降温后放置液氮中储存。
2、细胞冻存是细胞长期保存的重要手段。细胞冻存液通过冷冻保护剂在冻存过程中对细胞进行保护，以减少或防止冷冻冰晶对细胞造成的损伤。现有技术中的细胞冻存液通常包含培养基、胎牛血清和二甲基亚砜(dmso)等。dmso作为一种渗透性很强的细胞冷冻保护剂，其主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水，但是dmso具有毒性，当其量过多时会损伤细胞且复苏过程中容易导致干细胞氧化损伤与分化潜能降低。在临床应用中，部分患者在输注含dmso的细胞制剂后会出现皮疹，恶心
3、因此，目前我们急需一种新型的无dmso的细胞冻存液，能有效、安全地保护细胞，为细胞治疗的临床应用起到积极意义。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种无二甲基亚砜(dmso)的细胞冻存液，具体组成成分明确且易于获取，不影响冻存期间细胞的活性和干性，避免dmso带来的毒副作用。
2、本专利技术的第二目的在于提供上述无dmso细胞冻存液的应用。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
4、一种无dmso的细胞冻存液，包括基础冻存液和添加在基础冻存液中的以下成分：d-甘露醇、木栓酮、异甘草素、鞘氨醇-1-磷酸、l-丙氨酰甘氨酸、腺嘌呤、磷酸二氢钾；以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮10～25μg/ml、异甘草素5～20μg/ml、l-丙氨酰甘氨酸5.06～21.30μg/ml、d-甘露醇22～30μg/ml、鞘氨醇-1-磷酸1～20nm/ml、腺嘌呤25～50ng/ml、磷酸二氢钾60～120μg/ml。
5、进一步地，以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮18μg/ml、异甘草素15μg/ml、l-丙氨酰甘氨酸17.2μg/ml、d-甘露醇25μg/ml、鞘氨醇-1-磷酸10nm/ml、腺嘌呤35ng/ml、磷酸二氢钾80μg/ml。
6、进一步地，所述基础冻存液为dmem/f12培养基。
7、上述无dmso的细胞冻存液的应用，包括以下步骤：
8、s1：制备冻存液和细胞悬液；
9、s2：将细胞悬液与冻存液按1:1的体积比例混合均匀后，加入冻存管中；
10、s3：直接将冻存管放置在-80℃冷冻保存，24h后转移至液氮冻存。
11、进一步地，所述步骤s1中冻存液的制备过程如下：将d-甘露醇、木栓酮、异甘草素、鞘氨醇-1-磷酸、l-丙氨酰甘氨酸、腺嘌呤、磷酸二氢钾与基础冻存液均匀混合，获得细胞冻存液成品。
12、进一步地，所述细胞冻存液在配置完成后放置到4℃环境下保存。
13、进一步地，所述步骤s1中细胞悬液的制备过程如下：采用胰酶消化处于指数生长期的贴壁细胞，终止消化后离心弃上清，然后加入dmem/f12培养基进行重悬，悬液中细胞密度：1.5×106～2.5×106个/ml。
14、进一步地，所述贴壁细胞为间充质干细胞。
15、进一步地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的一种。
16、本专利技术的有益技术效果在于：本专利技术提供一种无dmso的细胞冻存液，该冻存液成分明确，将木栓酮、异甘草素和l-丙氨酰甘氨酸应用于细胞冻存，保护细胞不受冰晶形成的损伤，避免了加入dmso带来的不利影响；此外，还能够更好地维持细胞的生物学功能，使细胞冻存复苏后具有高的存活率，同时保持更好的分化能力，安全有效，符合产业转化要求。
17、上述无dmso的细胞冻存液应用于细胞冻存时，无需程序化冻存，可直接将细胞冻存管置于-80℃冻存，长期保存可在24h后移至液氮中，极大节约时间成本和经济成本，方便了临床的应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种无DMSO的细胞冻存液，其特征在于，包括基础冻存液和添加在基础冻存液中的以下成分：D-甘露醇、木栓酮、异甘草素、鞘氨醇-1-磷酸、L-丙氨酰甘氨酸、腺嘌呤、磷酸二氢钾；以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮10～25μg/mL、异甘草素5～20μg/mL、L-丙氨酰甘氨酸5.06～21.30μg/mL、D-甘露醇22～30μg/mL、鞘氨醇-1-磷酸1～20nM/mL、腺嘌呤25～50ng/mL、磷酸二氢钾60～120μg/mL。
2.根据权利要求1所述一种无DMSO的细胞冻存液，其特征在于，以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮18μg/mL、异甘草素15μg/mL、L-丙氨酰甘氨酸17.2μg/mL、D-甘露醇25μg/mL、鞘氨醇-1-磷酸10nM/mL、腺嘌呤35ng/mL、磷酸二氢钾80μg/mL。
3.根据权利要求1所述一种无DMSO的细胞冻存液，其特征在于，所述基础冻存液为DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求1至3任一项所述的一种无DMSO的细胞冻存液的应用，其特征在于，包括以下步骤：
5.根
6.根据权利要求4所述的一种无DMSO的细胞冻存液的应用，其特征在于，所述步骤S1中细胞悬液的制备过程如下：采用胰酶消化处于指数生长期的贴壁细胞，终止消化后离心弃上清，然后加入DMEM/F12培养基进行重悬，细胞密度：1.5×106～2.5×106个/mL。
7.根据权利要求6所述的一种无DMSO的细胞冻存液的应用，其特征在于，所述贴壁细胞为间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的一种无DMSO的细胞冻存液的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的一种。
...【技术特征摘要】
1.一种无dmso的细胞冻存液，其特征在于，包括基础冻存液和添加在基础冻存液中的以下成分：d-甘露醇、木栓酮、异甘草素、鞘氨醇-1-磷酸、l-丙氨酰甘氨酸、腺嘌呤、磷酸二氢钾；以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮10～25μg/ml、异甘草素5～20μg/ml、l-丙氨酰甘氨酸5.06～21.30μg/ml、d-甘露醇22～30μg/ml、鞘氨醇-1-磷酸1～20nm/ml、腺嘌呤25～50ng/ml、磷酸二氢钾60～120μg/ml。
2.根据权利要求1所述一种无dmso的细胞冻存液，其特征在于，以所述冻存液终体积计，各成分的浓度为：木栓酮18μg/ml、异甘草素15μg/ml、l-丙氨酰甘氨酸17.2μg/ml、d-甘露醇25μg/ml、鞘氨醇-1-磷酸10nm/ml、腺嘌呤35ng/ml、磷酸二氢钾80μg/ml。
3.根据权利要求1所述一种无dmso的细胞冻存液，其特征在于，所述基础冻存液为dmem/f12培养基。
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【专利技术属性】
技术研发人员：章志国，邹慧娟，陈蓓丽，邹薇薇，曹云霞，
申请(专利权)人：安徽医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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