【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种耐高温的谷氨酸脱羧酶及其制备方法与应用。
技术介绍
1、γ-氨基丁酸(gaba)是广泛存在于脊椎动物、植物及微生物中，是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，具有降低血压，治疗癫痫，治疗酒精依赖症，改善脑功能、脂质代谢，促使精神安定，促进记忆、生长激素的分泌、肾功能活化、肝功能活化，防止皮肤老化，清除体臭，广泛用于医药、食品、化工等领域。
2、gaba的产生是通过谷氨酸脱羧酶(gad)，依赖磷酸吡哆醛(plp)，催化谷氨酸或谷氨酸钠脱羧形成的。gaba制备方法主要有化学直接合成法、植物富集提取法、生物酶法及微生物发酵法。化学直接合成法在制备过程中会产生吡咯烷酮、丁内酯、γ-氯丁氰等不安全副产物，且反应条件苛刻，产品纯度可能不够高；植物富集提取法存在植物培养周期长、获得产物效率低等问题。微生物发酵法，简单，高效，绿色，但产物提取困难。而生物酶法制备的gaba产品纯度高，生产过程安全，环保等优势，为目前较为理想的gaba制备方法。
3、微生物来源的gad研究较为广泛，主要包括短乳杆菌、植物乳杆菌、大肠杆菌、链霉菌属、巨大芽孢杆菌等，但这些来源的gad难以满足工业应用需求。因此如何找到催化性能优良的gad是目前工业化应用的主要问题。希氏乳杆菌(lactobacillushilgardii)作为国家卫生安全局批准的用于制备γ-氨基丁酸的主要微生物，而高产gaba的希氏乳杆菌的gad的催化性能的研究与应用还处于空白。
4、综上所述，如何有针对的挖掘高产gaba的乳杆菌
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供了一种耐高温的谷氨酸脱羧酶及其制备方法与应用，所述的谷氨酸脱羧酶来源于希氏乳杆菌，可利用谷氨酸/谷氨酸钠为底物，具有耐高温，ph稳定的谷氨酸脱羧酶催化脱羧产生具有生物活性功能的γ-氨基丁酸。
2、为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：
3、一种耐高温的谷氨酸脱羧酶，来源于希氏乳杆菌，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述耐高温的谷氨酸脱羧酶的最适酶活温度为60℃，在40～70℃下，相对酶活力均保持80％以上，30℃时，相对酶活力均保持60％以上；最适ph为4.4，ph 4.0～5.2内，酶活力保持80％以上。
4、优选的是，编码耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、一种重组表达载体，包含编码上述耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列。
6、一种重组菌株，包含上述重组表达载体的菌株。
7、优选的是，所述菌株为大肠杆菌，乳杆菌或乳球菌。
8、上述一种耐高温的谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤：
9、(1)重组表达载体：
10、将his标签和tev标签加至序列seq id no.2的前端，并在两端引入smai与xhoi两个酶切位点，采用双酶切连接至pet28a质粒上，构建重组表达载体；
11、(2)构建重组菌株：
12、将重组表达载体转入菌株，并对宿主细胞进行扩大培养、0.1～0.5mm iptg诱导蛋白表达；
13、(3)收集诱导培养后的宿主细胞，进行破碎、离心，得到细胞上清液；
14、(4)对上清液进行纯化处理，得希氏乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶。
15、优选的是，步骤(4)中所述的纯化处理包括ni bestarose亲和层析、tev蛋白酶消化、ni bestarose亲和层析或尺寸排阻色谱-hiload 16/600superdex纯化。
16、上述一种耐酸耐高温的谷氨酸脱羧酶在催化谷氨酸或谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸上的应用。
17、优选的是，所述催化反应的体系包括0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液，0.04mmol/lplp、100mmol/l l-谷氨酸钠或l-谷氨酸、与0.2mg/ml谷氨酸脱羧酶。
18、优选的是，所述生产γ-氨基丁酸采用连续全细胞催化生产，具体方法为：将权利要求4所述的重组菌株培养或经谷氨酸脱羧酶诱导表达后，制备成全细胞催化菌泥；菌泥经过0.025％曲拉通处理后(于37℃、100rpm，0.5h)，在ph 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液、0.4mmol/l plp，175mmol/l l-谷氨酸钠体系中，37℃催化反应，每30min投入40g/l l-谷氨酸，保持ph为4.5，连续催化6h后，回收全细胞，重新进行连续催化合成γ-氨基丁酸，整个反应时间为12h。
19、有益效果：
20、与现有技术相比，本专利技术一种耐高温的谷氨酸脱羧酶及其制备方法与应用，所述耐高温的谷氨酸脱羧酶来源于高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌(cgmcc no.26755)，该酶在70℃条件下，催化活性仍能维持80％，是一种耐高温的谷氨酸脱羧酶，且ph为3时，酶的催化活性维持在60％，是一种耐酸的谷氨酸脱羧酶。该酶以作为国家卫生部规定的γ-氨基丁酸产生菌，目前关于其的谷氨酸脱羧酶的序列及其酶学性质的探究处于空白。本专利技术通过解析希氏乳杆菌源的谷氨酸脱羧酶，对酶资源的开发、具有重要价值，同时制备谷氨酸脱羧酶纯酶可催化制备食品级、医药级γ-氨基丁酸，提高γ-氨基丁酸的工业化应用。
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1.一种耐高温的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述耐高温的谷氨酸脱羧酶来源于希氏乳杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述耐高温的谷氨酸脱羧酶的最适酶活温度为60℃，在40～70℃下，相对酶活力均保持80％以上，30℃时，相对酶活力均保持60％以上；最适pH为4.4，pH 4.0～5.2内，酶活力保持80％以上。
2.根据权利要求1所述的耐高温的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，编码耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述重组表达载体的菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌，乳杆菌或乳球菌。
6.基于权利要求1所述的一种耐高温的谷氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的纯化处理包括NiBestarose亲和层析、TEV蛋白酶消化、Ni Be
8.基于权利要求1所述的一种耐高温的谷氨酸脱羧酶在催化谷氨酸或谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述催化反应的体系包括0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，0.04mmol/L PLP、100mmol/L L-谷氨酸钠或L-谷氨酸、0.2mg/mL谷氨酸脱羧酶。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生产γ-氨基丁酸采用连续全细胞催化生产，具体方法为：将权利要求4所述的重组菌株培养或经谷氨酸脱羧酶诱导表达后，制备成全细胞催化菌泥；菌泥经过0.025％曲拉通处理后，在pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液、0.4mmol/L PLP，175mmol/L L-谷氨酸钠体系中，37℃催化反应，每30min投入40g/L L-谷氨酸，保持pH为4.5，连续催化6h后，回收全细胞，重新进行连续催化合成γ-氨基丁酸，整个反应时间为12h。
...【技术特征摘要】
1.一种耐高温的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述耐高温的谷氨酸脱羧酶来源于希氏乳杆菌，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述耐高温的谷氨酸脱羧酶的最适酶活温度为60℃，在40～70℃下，相对酶活力均保持80％以上，30℃时，相对酶活力均保持60％以上；最适ph为4.4，ph 4.0～5.2内，酶活力保持80％以上。
2.根据权利要求1所述的耐高温的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，编码耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的耐高温的谷氨酸脱羧酶的核苷酸序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述重组表达载体的菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌，乳杆菌或乳球菌。
6.基于权利要求1所述的一种耐高温的谷氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的纯化处理包括nibestaro...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫璐婵，沈凯慧，邹晓洲，李婷婷，罗冰冰，雷正艳，吕舒怡，王俊，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
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