【技术实现步骤摘要】
本专利技术于生物工程，具体涉及一种靶向革兰氏阴性菌抗菌肽及其壳聚糖纳米微粒和应用。
技术介绍
1、抗菌肽是生物体内普遍存在的具有广谱抗菌活性的一类小分子多肽，具有生物学活性高、绿色无残留等特点，这种特性使抗菌肽对病原菌和益生菌均具有抗菌能力。因此，设计出具有靶向抗菌能力的抗菌肽可有效针对细菌发挥作用。髓样分化蛋白md-2与lps结合的氨基酸片段对革兰氏阴性菌的抗菌活性较弱，通过氨基酸替代的方式对该片段进行改造，有望获得对革兰氏阴性菌具有靶向作用的新型抗菌肽。
2、然而，抗菌肽半衰期短，无法实现长效抑菌，在消化道中易被蛋白酶降解。随着纳米技术的不断进步，将抗菌肽进行包被制备成纳米微粒有望提高其生物利用度，增强其在体内的稳定性。大部分传统纳米微粒在体内会迅速被网状内皮系统吞噬，而作为制备纳米微粒材料的壳聚糖克服了这一缺点，可以延长药物在体内循环的时间，达到更好的抑菌效果。
技术实现思路
1、基于以上不足之处，本专利技术提供了一种靶向革兰氏阴性菌抗菌肽fr5，具有靶向革兰氏阴性菌的功能。
2、本专利技术所采用的技术方案如下：一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽fr5，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其c端采用-nh2酰胺化。
3、本专利技术的另一目的是提供一种靶向革兰氏阴性菌抗菌肽fr5的制备方法，步骤如下：
4、s1：采用氨基酸替代法，向髓样分化蛋白md-2与lps结合的氨基酸片段中的第4，7位点引入精氨酸，得到的多肽序列如seq id
5、s2：采用固相化学合成法，使用多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到多肽；再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备；
6、s3：再将所述的多肽经过最小抑菌浓度检测、溶血活性检测，最后命名为抗菌肽fr5。
7、本专利技术的另一目的是提供一种靶向革兰氏阴性菌的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps，包含如上所述的抗菌肽fr5，解决了抗菌肽在消化道中易被蛋白酶降解的问题。
8、本专利技术的另一目的是提供如上所述的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps的制备方法，方法步骤如下：
9、s1：壳聚糖溶液的制备：用无菌水配制体积百分数为1％的乙酸溶液，将30mg壳聚糖粉末溶于所述的乙酸溶液中，最终含有壳聚糖的浓度为1mg/ml，在25℃，210rpm下磁力搅拌30min后，用10m naoh溶液调整至壳聚糖溶液的ph＝5.5备用；
10、s2：纳米微粒的制备：配制1mg/ml的三聚磷酸钠溶液，将60μg/ml的抗菌肽fr5添加到已制备好的壳聚糖溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入三聚磷酸钠溶液至壳聚糖溶液中，其中，壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比例为3:1，在25℃，210rpm下继续磁力搅拌2h，自发形成壳聚糖纳米微粒悬液；
11、s3：纯化冻干：将制备的纳米微粒悬液在4℃，14000×g下离心45min，用无菌水冲洗沉淀，弃去上清后可以得到凝胶状沉淀，使用冷冻干燥机对沉淀进行冻干，完成壳聚糖纳米微粒的制备。
12、进一步的，如上所述的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps，壳聚糖的分子量范围50-190kda，脱乙酰程度75-85％。
13、本专利技术的另一目的是提供如上所述的靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽fr5在制备治疗和/或预防革兰氏阴性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
14、进一步的，如上所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
15、本专利技术的另一目的是提供如上所述的靶向革兰氏阴性菌的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps在制备治疗和/或预防革兰氏阴性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
16、进一步的，如上所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌或啮齿类柠檬酸杆菌。
17、本专利技术的另一目的是提供一种适用于治疗和/或预防革兰氏阴性菌感染的药物，所述药物含有如上所述的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps。
18、本专利技术具有如下有益效果及优点：本专利技术的抗菌肽fr5对革兰氏阴性菌具有靶向抗菌活性。本专利技术采用壳聚糖作为纳米壁材，构建包被抗菌肽的纳米微粒，可以提高抗菌肽在蛋白酶和人工胃肠液中的稳定性，延长抗菌肽的释放时间，进而达到长效抑菌的效果，克服抗菌肽在实际应用中的局限性，推动了抗菌肽的产业化进程。同时通过纳米缓释作用延长抗菌时效，降低添加成本，可广泛应用于医药、食品、农业、工业、畜牧业等领域。
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1.一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽FR5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端采用-NH2酰胺化。
2.根据权利要求1所述的一种靶向革兰氏阴性菌抗菌肽FR5的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
3.一种靶向革兰氏阴性菌的壳聚糖纳米微粒FR5-CS-NPs，其特征在于：包含如权利要求1所述的抗菌肽FR5。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖纳米微粒FR5-CS-NPs的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
5.根据权利要求3所述的壳聚糖纳米微粒FR5-CS-NPs，其特征在于：壳聚糖的分子量范围50-190kDa，脱乙酰程度75-85％。
6.根据权利要求1所述的一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽FR5在制备治疗和/或预防革兰氏阴性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
8.根据权利要求3所述的一种靶向革兰氏阴性菌的壳聚糖纳米微粒FR5-CS-NPs在制备治疗和/或预防革兰氏阴性菌引发的感染性疾病的药
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌或啮齿类柠檬酸杆菌。
10.一种适用于治疗和/或预防革兰氏阴性菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求3所述的壳聚糖纳米微粒FR5-CS-NPs。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向革兰氏阴性菌的抗菌肽fr5，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其c端采用-nh2酰胺化。
2.根据权利要求1所述的一种靶向革兰氏阴性菌抗菌肽fr5的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
3.一种靶向革兰氏阴性菌的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps，其特征在于：包含如权利要求1所述的抗菌肽fr5。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
5.根据权利要求3所述的壳聚糖纳米微粒fr5-cs-nps，其特征在于：壳聚糖的分子量范围50-190kda，脱乙酰程度75-85％。
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【专利技术属性】
技术研发人员：吕银凤，周楚乔，黄欣月，孟童童，卞译烽，单安山，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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