【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质工程，尤其涉及一种高活性重组纤连蛋白及其组合物、制备与应用。
技术介绍
1、纤连蛋白(fn)是一种重要的细胞外基质糖蛋白，具有广泛的生物学功能，包括细胞粘附、迁移和增殖等，其分子量约为440kda的大糖蛋白，由2个分子质量为220kda道尔顿的亚基通过二硫键连接而成的二聚体。由一系列多个重复模块结构组成，12个fn i型重复序列(～41-50aa)，2个fn ii型重复序列(～60aa)，15个fn iii型重复序列(～90aa，不含组氨酸、二硫键)和2个交替剪接位点(eda和edb)，以及一个可变区(v)。
2、市场上现有的全长fn蛋白均为血浆提取纯化，因为其受限于来源，成本高产量低。重组蛋白的方法可以低成本生产大量高纯度的fn蛋白，但因为fn具有复杂的高级结构，同时在i型结构域富含二硫键，作为重组蛋白，无论是表达还是纯化，均有非常高的难度，现有fn重组蛋白相关产品和专利技术(如cn117586379a、cn117143224a)以表达量为目标均删除了大量原始fn的结构域，其功能性相比天然fn会有所缺失。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本项目技术创新点之一是序列设计，在确保重组蛋白的高效表达并能够稳定纯化的同时，包含尽可能多的天然fn蛋白的结构域以实现更多和/或更高的生物活性。本专利技术人研究人源全长fn蛋白与胶原蛋白以及透明质酸等分子的相互作用，筛选出部分结构域，再通过生物化学、细胞实验等去筛选和验证相关序列的功能和效果。
2、因
3、本专利技术还提供了编码所述的重组纤连蛋白的基因。
4、优选地，编码本专利技术重组纤连蛋白的核苷酸序列如seq id no：2所示。
5、fn蛋白带有i型功能结构域在大肠杆菌和酵母体系非常难以表达和纯化，因为其带有大量二硫键，对宿主细胞内质网二硫键正确折叠能力的要求非常高。
6、为解决此问题，本专利技术一方面在序列设计端删除非功能区域编码半胱氨酸的序列，另一方面通过基因工程等手段在宿主中引入人源二硫键异构酶(pdi)，uniprotkb id：p07237，构建能够高效折叠二硫键的底盘细胞，以实现重组纤连蛋白的高效表达。
7、因此，本专利技术的第二个目的是提供重组纤连蛋白表达系统，包括重组载体、辅助成分、重组细胞。
8、本专利技术提供了含有编码重组纤连蛋白基因的重组载体，以及含有编码人源二硫键异构酶基因的重组载体。
9、载体包括衍生自任何来源并且能够基因组整合或自主复制的任何核酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链dna或rna核酸分子)，其包含已可操作连接的一种或更多种核酸分子的核酸分子。载体可以包括，例如一个或多个可选择的标记物、一个或多个复制起点(例如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点、和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。优选的，所述载体包括但不限于pet22b、pcdfduet-1、ppiczαa和ppic9k。
10、本专利技术提供了表达所述的重组纤连蛋白的重组细胞，所述重组细胞中含有所述的重组载体。
11、所述重组细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母、脯乳动物细胞。
12、本专利技术还提供所述重组纤连蛋白表达的方法。
13、在一优选例中，所述重组纤连蛋白是在大肠杆菌优选在大肠杆菌origami b中表达，包括以下步骤：
14、1)将所述的基因连接到载体pet22b上获得重组载体；
15、2)将所述的重组载体转染至大肠杆菌origami b中获得重组细胞；
16、3)培养所述的重组细胞后，离心，收集上清液；
17、4)从所述的上清液中分离纯化获得所述的重组纤连蛋白。
18、更优选地，还包括将编码人源二硫键异构酶(pdi)的基因片段，构建到表达载体pcdfduet-1上获得重组载体pcdfduet-1-pdi，转染至大肠杆菌origami b。
19、本专利技术第三个目的是提供包含所述的重组纤连蛋白，还包含透明质酸和/或胶原蛋白。
20、具体地，本专利技术重组纤连蛋白可与重组或天然的i型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、iv型胶原蛋白、v型胶原蛋白、人表皮生长因子、透明质酸等任意一种或多种的生物活性成分混合使用。
21、本专利技术的第四目的是提供所述的重组纤连蛋白、所述制备方法制备获得的重组纤连蛋白或所述组合物包括有以下任一项中的应用：
22、i)促进细胞粘附、增殖或迁移；
23、ii)制备化妆品；
24、iii)制备医用材料。
25、在一应用中，本专利技术重组纤连蛋白可以作为培养液基本成分促进细胞增殖、细胞黏附和/或细胞迁移，可用于3d细胞培养、组织器官构建和创伤修复中诱导细胞定向迁移与黏附。
26、在另一应用中，以本专利技术重组纤连蛋白为主要成分制备化妆品包括但不限于护肤液、护肤霜、精华水、面膜、头皮精华液、洗发露。
27、在另一应用中，以本专利技术重组纤连蛋白为主要成分制备医用材料包括但不限于修复材料、植入剂，其中修复材料包括但不限于创面敷料，重组纤连蛋白还可以作为涂布于医疗器材和移植物材料上的生物涂层，提高其生物相容性。
28、基于此，本专利技术可以根据实际应用选择一种包括美容上或药学上有效量的至少一种根据前述的蛋白以及至少一种赋形剂或美容上或药学上可接受的佐剂的组合物。所述组合物的剂型包括但不限于膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、贴类、膜类或冻干类；进一步地，可以利用无纺布等固体载体制备成贴类产品，贴敷于皮肤表面，延长作用时间。
29、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
30、本专利技术重组纤连蛋白序列是基于人纤连蛋白的原始氨基酸序列优化得到，具有良好生物相容性；筛选fn蛋白的结构域形成全新的重组蛋白，在宿主中引入人源二硫键异构酶(pdi)，构建能够高效折叠二硫键的底盘细胞，使得重组蛋白能够同时实现高效表达和更好地发挥生物活性。
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1.一种重组纤连蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的重组纤连蛋白的基因。
3.表达权利要求1所述的重组纤连蛋白的重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。
4.表达权利要求1所述的重组纤连蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括将编码人源二硫键异构酶(PDI)的基因片段，构建到表达载体pCDFDuet-1上获得重组载体pCDFDuet-1-PDI，转染至大肠杆菌Origami B。
7.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的重组纤连蛋白，还包含透明质酸。
8.权利要求1所述的重组纤连蛋白、权利要求5所述制备方法制备获得的重组纤连蛋白和权利要求7所述的组合物包括有以下任一项中的应用：
【技术特征摘要】
1.一种重组纤连蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.编码权利要求1所述的重组纤连蛋白的基因。
3.表达权利要求1所述的重组纤连蛋白的重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。
4.表达权利要求1所述的重组纤连蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：张影，罗旻，李静柔，刘敏敏，冯宇驰，朱刘，葛建敬，
申请(专利权)人：深圳粒影生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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