【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种清香型白酒酿造过程中检测乳酸菌的引物和方法。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、白酒生产过程中酿造微生物群落形成复杂的微生物生态系统。微生物的代谢产物如醇类、酯类、酸类等，直接或间接影响着白酒的出酒率及酒质。传统白酒酿造工艺关键的应用基础科学问题是如何在较短时间内实现对功能微生物菌群的快速定量检测。早期科研工作者们对白酒微生物的研究方法主要依赖于可培养的微生物研究方法，对白酒生产不同阶段的微生物进行分离鉴定、研究各阶段微生物的数量及种类变化。或者，将分离的纯种菌株进行发酵，检测代谢产物以研究分离菌株的功能。随着分子生物学技术的发展，利用非培养方法研究中国白酒的微生物区系引起了中国学者的极大兴趣。
3、常见的非培养的分子生物学方法包括pcr-dgge技术、磷脂脂肪酸分析技术(plfa)、荧光原位杂交技术(fish)、实时定量pcr、流式细胞术、基于高通量测序技术的宏基因组学等。pcr-dgge检测技术具有多拷贝、无法绝对定量等局限性。荧光原位杂交对探针设计要求高，而流式细胞术对设备的要求及检测成本均较高。各种组学的方法也正逐渐应用到酿酒微生物的研究当中，如宏基因组学、转录组学、代谢组学等。通过多组学方法整合，可实现微生物多样性分析、功能研究、交互作用研究等。这些方法虽然具备全面性和多种优势，但是仍然无法应用于生产过程酿酒功能微生物菌群的快速检测和监
技术实现思路
1、针对本次方案实施过程中，依然存在不可或缺的问题，例如在实时荧光定量pcr过程中，引物的设计问题存在筛选耗时、特异性要求高等问题，由于微生物在种水平之间序列相似性较高，因此引物的特异性会因为一俩个碱基的不同而出现较低的特异性，因此筛选特异性引物是当前需要解决的一个问题。本专利技术采用实时荧光定量pcr技术分别设计了针对植物乳酸菌和布氏乳酸菌的特异性引物，优化了混菌检测体系，能够实现同时检测这两种乳酸菌，有效解决了清香型白酒酿造过程中关键功能微生物的快速定量问题。
2、针对现有技术中的不足，本专利技术采用的技术方案如下：
3、在本专利技术的第一个方面，提供一种清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的特异性引物对，核苷酸序列分别如seq id no.1-2和seq id no.3-4所示。
4、植物乳杆菌和布氏乳杆菌分别为lactobacillusplantarum和lactobacillusbuchneri。
5、在本专利技术的第二个方面，提供一种清香型白酒酿造过程中检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的试剂盒，该试剂盒包括上述特异性引物对。
6、在本专利技术的第三个方面，提供上述的特异性引物对和/或上述的试剂盒在清香型白酒酿造过程中对植物乳杆菌和/或布氏乳杆菌的定量应用。
7、在本专利技术的第四个方面，提供一种汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌方法，该方法包括以下步骤：
8、1)待测样本中dna的提取；
9、2)以dna为模板，通过上述引物对进行pcr基因扩增；
10、3)电泳观察：反应结束后取pcr产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳观察，当扩增片段为114bp，则样本中含有植物乳杆菌；当扩增片段为120bp，则样本中含有布氏乳杆菌。
11、步骤1)中的具体方法包括：
12、(1)将无菌水加入待测样本中，震荡，吸取上清液稀释，取稀释液涂布于mrs固体培养基，待其出现形态均一的菌落后进行后续操作；挑取单菌落于mrs液体培养基，过夜培养后进行基因组的提取；
13、用移液枪吸取1ml菌液于1.5ml离心管中离心，转速为12000rpm，离心1分钟，弃上清保留沉淀，重复多次直至5ml试管内菌液处理完为止。
14、(2)用移液枪吸取1mlste缓冲液加入离心管中吹打混匀，离心机转速为12000rpm，离心1分钟，重复一次。
15、(3)之后加入ste缓冲液300μl，100g/ml溶菌酶30μl，以裂解菌体，于37℃、200rpm振荡15min。
16、(4)移液枪吸取35μl的10％sds溶液以及5μl蛋白酶k，分别加入离心管中。之后置于55℃至65℃的水浴锅中加热30～60分钟。
17、(5)用移液枪吸取70μl的1mol/lnacl溶液，迅速加入离心管，吹打混匀。然后转速为12000rpm，离心5分钟，最后吸取上清液至新的ep管中。
18、(6)将等体积抽提酚加入离心管，振荡混匀，离心机转速为12000rpm，持续离心2分钟，之后吸取上清至新的ep管中。
19、(7)将等体积氯仿加入离心管，振荡混匀，离心机转速为12000rpm，持续离心2分钟，之后吸取上清至新的ep管中，重复一次。
20、(8)将0.6倍体积异丙醇加入离心管，振荡混匀，离心机转速为12000rpm，持续离心2分钟，之后吸取上清至新的ep管中，吸取200～500μl 75％的乙醇，将沉淀吹打混匀，再用移液枪吸出离心管中的乙醇，重复3次，然后将离心管放置于37℃金属浴中烘干。
21、(9)加入50μl的ddh2o和3μl rnasea酶，之后在55℃水浴锅中水浴20min；
22、(10)用微量分光光度仪对dna模板浓度进行测定，得到对应菌液基因组浓度的数据，单位为ng/μl。
23、(11)将获得的dna模板放入-20℃冰箱保存备用。
24、步骤2)中，pcr反应体系为50μl，体系包括2×transfasttaqpcr super mix 25μl，nuclease-freewater22μl，10μmol/l的上、下引物各1μl，dna模板1μl。
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的特异性引物对，其特征是，分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。
2.如权利要求1所述的清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的特异性引物对，其特征是，植物乳杆菌和布氏乳杆菌分别为Lactobacillusplantarum和Lactobacillus buchneri。
3.一种清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的试剂盒，其特征是，该试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物对。
4.权利要求1所述的特异性引物对和/或权利要求3所述的试剂盒在清香型白酒酿造过程中对植物乳杆菌和/或布氏乳杆菌的定量应用。
5.一种汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌方法，其特征是，该方法还包括以下步骤：
7.如权利要求5所述的汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌方法，其特征是，PCR反应体系为50μL，
8.如权利要求5所述的汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌方法，其特征是，植物乳杆菌PCR反应程序如下：预变性：94℃，5min；30个循环：变性：94℃，30s；退火：50℃，30s；延伸：72℃，30s；终延伸：72℃，10min；
...【技术特征摘要】
1.一种清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的特异性引物对，其特征是，分别如seq id no.1-2和seq id no.3-4所示。
2.如权利要求1所述的清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的特异性引物对，其特征是，植物乳杆菌和布氏乳杆菌分别为lactobacillusplantarum和lactobacillus buchneri。
3.一种清香型白酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆菌的试剂盒，其特征是，该试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物对。
4.权利要求1所述的特异性引物对和/或权利要求3所述的试剂盒在清香型白酒酿造过程中对植物乳杆菌和/或布氏乳杆菌的定量应用。
5.一种汾酒酿造过程中快速检测植物乳杆菌和布氏乳杆...
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