【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫苗与兽用生物制品，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、牛病毒性腹泻/黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，bvdv)引起的一种急性、接触性传染病。bvdv除感染牛外，还可感染猪、羊、鹿等多种家畜和野生动物，病毒感染可损害感染动物的消化、呼吸、生殖系统，并会引起免疫抑制增加其他病原的感染，给畜牧业造成严重经济损失。
2、bvdv是黄病毒科瘟病毒属的成员，为单股正链rna病毒。基因组全长12.3-12.5kb，含有一个可以编码约4000个氨基酸多聚蛋白的orf，多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的蛋白，其中c、erns、e1、e2是病毒的结构蛋白。结构蛋白erns和e2是最具免疫原性的蛋白质。erns蛋白是一种高度糖基化蛋白质，有少量的中和表位，诱导机体产生抗erns的中和抗体,可以调控宿主的免疫反应。e2蛋白是bvdv的囊膜蛋白，含有病毒重要的抗原决定簇，是病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生保护性的中和抗体。e2蛋白对病毒rna的装配或病毒粒子的组装、病毒与受体或感染的细胞之间的互相作用非常重要。
3、牛病毒性腹泻的防控目前仍以疫苗防控为主。在欧美国家使用的疫苗主要包括减毒活疫苗和灭活疫苗，多与牛的其他病毒如牛传染性鼻气管炎、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒等组成多联多价疫苗。国内可以应用的仅有灭活疫苗，包括bvdv1型单苗和牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗。灭活疫苗
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗及其制备方法，解决了目前bvdv亚单位疫苗研发目前多集中于采用原核表达系统表达e2蛋白，原核表达蛋白产物多以包涵体形式表达，不方便蛋白纯化，缺乏糖基化修饰等问题，同时添加了erns蛋白，更好的增强了bvdv亚单位疫苗的免疫原性。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
4、步骤1.对牛病毒性腹泻病毒erns蛋白核苷酸序列进行优化，优化后的牛病毒性腹泻病毒erns蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示；对牛病毒性腹泻病毒e2蛋白核苷酸序列进行优化，优化后的牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的核苷酸序列如seq id no.3所示；
5、步骤2.将信号肽序列和优化后的牛病毒性腹泻病毒erns蛋白的核苷酸序列克隆到真核表达载体中得到含有牛病毒性腹泻病毒erns蛋白重组质粒；将信号肽序列和优化后的牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的核苷酸序列克隆到真核表达载体中得到含有牛病毒性腹泻病毒e2蛋白重组质粒；
6、步骤3.将两种重组质粒分别转染至悬浮培养的cho-s细胞中悬浮培养，收集细胞培养上清，然后将细胞培养上清纯化分别得到牛病毒性腹泻病毒erns蛋白和e2蛋白；
7、步骤4.将erns蛋白和e2蛋白按照质量比进行混合，然后加入疫苗佐剂获得牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗。
8、进一步的，所述步骤2中信号肽序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9、进一步的，所述步骤3中得到牛病毒性腹泻病毒erns蛋白和e2蛋白具有完整糖基化修饰。
10、进一步的，所述步骤4中质量比为1：1～3，优选为1：1～2。
11、进一步的，所述步骤4中的疫苗佐剂为isa201vg、isa206vg或isa660vg中的任意一种。
12、进一步的，所述步骤4中疫苗佐剂按照油相与水相体积比55:45添加。
13、一种牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗，所述牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗由上述方法制备而成。
14、本专利技术的有益效果：在制备蛋白表达载体时，添加增加分泌表达的信号肽序列，并将蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，提高蛋白的分泌表达和蛋白表达量；通过cho真核表达系统表达具有糖基化修饰的蛋白，更接近天然蛋白构象；在亚单位疫苗制备过程中，添加了erns蛋白，通过优化erns蛋白和e2蛋白的质量比进行疫苗配置，免疫牛后，疫苗对牛安全，且可产生优于单纯e2蛋白的亚单位疫苗免疫效果。攻毒试验表明，erns-e2亚单位疫苗对国内流行毒株bvdv-jl具有良好保护效果。
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1.一种牛病毒性腹泻病毒Erns-E2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中信号肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中得到牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白和E2蛋白具有完整糖基化修饰。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中质量比为1：1～3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中质量比为1：1～2。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的疫苗佐剂为ISA201VG、ISA206VG或ISA660VG中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中疫苗佐剂按照油相与水相体积比55:45添加。
8.一种牛病毒性腹泻病毒Erns-E2亚单位疫苗，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒Erns-E2亚单位疫苗由权利要求1-7任一项所述的方法制备而成。
【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒erns-e2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中信号肽序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中得到牛病毒性腹泻病毒erns蛋白和e2蛋白具有完整糖基化修饰。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中质量比为1：1～3。
5.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张淑琴，谭斌，张傲，王佳慧，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：
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