【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种靶向致病性弧菌pira毒素蛋白的单域抗体及其在免疫检测中的应用，特别是针对虾急性肝胰腺坏死病(ahpnd)免疫检测中的应用。
技术介绍
1、急性肝胰腺坏死症(acute hepatopancreas necrosis disease，ahpnd)是一种细菌性疾病，系由感染携带pva1质粒的副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus，vpahpnd)引起。pva1质粒携带编码photorhabdus insect-related(pir)毒素piravp和pirbvp的基因，piravp和pirbvp结合形成二元毒素，破坏宿主消化器官，包括肝胰腺、胃和肠道的上皮细胞膜，导致细胞损伤，引起功能障碍，造成死亡。对虾是ahpnd的易感宿主，在苗种期和成体养殖期均有发生，染病个体变现为生长缓慢，肝胰腺萎缩，空肠空胃等症状，在染病7-20天内死亡率可达100％。自2009年ahpnd被发现至今，ahpnd在亚洲、南美洲等对虾主养殖区域频繁爆发。目前，商品市场上仍未有控制ahpnd感染和传播的有效药物，因此，建立快速、准确的ahpnd病原诊断方法，实现早期筛查，以便及时采取预防措施，对养殖生产具有重要意义。
2、长期以来，ahpnd的病原检测主要依靠基于pcr的分子方法，如real-time pcr、rpa和lamp等，该类方法灵敏度高、准确性好，但是，此类方法对检测人员技术要求高，设备依赖性强，现场检测难度大。同时，研究表明，ahpnd发病根源是pira/b二元毒素蛋白对宿主消
3、免疫学诊断技术已在水产病害诊断领域广泛应用，虽然其在检测灵敏度方面稍逊于分子诊断，但因其具有操作简单、检测结果可视化和现场检测等优势使其成为病原检测的常规手段。近年来，已有研究人员制备了pira/b的卵黄抗体和鼠源单克隆抗体，并基于间接酶联免疫吸附法(ielisa)和斑点杂交法(dot blot)开发了ahpnd的检测试剂盒。现有的检测产品不足之处在于，其一，在检测抗体原料方面，卵黄抗体属于多克隆抗体，缺乏恒定的再生源，不同批次间易产生批间差；同时，单克隆抗体的生产成本较高，并且基于单克隆抗体的ahpnd检测试剂盒需冷链运输和冷藏保存，运输和保存成本也比较高。其二，在检测方法方面，上述ielisa和dot blot方法的技术操作要求对于养殖人员而言仍不够简便，并且检测时间至少需4-6小时，耗时较长，因而亦未在养殖生产中大面积推广使用。
4、鲨源单域抗体(variable new antigen receptor，vnar)是目前可结合抗原的最小单位，其分子量12-15kd，仅为传统单抗的约1/10。与传统抗体相比，vnar具备稳定性好、抗逆性强(在40℃环境放置30天、置于ph 2.0-10.0或含有去垢剂的环境中，仍保持较高抗体活性)、抗原识别能力强(结构特殊，能识别隐藏抗原表位)和抗体生产周期短且成本低廉(结构简单，通过原核或酵母表达系统即可大量生产)等独特优势。公开号为cn117209601a的中国专利公开了一种靶向虾原肌球蛋白的噬菌体展示鲨源单域抗体及其应用，其中具体公开了从条纹斑竹鲨天然文库中筛选得到的稳定性高，分子量小的单域抗体，并可用于食品中虾类过敏物质的试纸条快速检测。
5、目前，尚未有靶向pira的鲨源单域抗体且基于免疫层析技术针对ahpnd病原检测的相关研发报道。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体及其在免疫检测中的应用。通过原核表达系统获得能够特异性结合pira不同抗原表位的单域抗体。随后，将获得的pira单域抗体应用于胶体金检测试纸开发，从而提供一种特异性好、操作简便、价格经济的ahpnd病原检测方法。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术提供一种靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列如下述序列之一：
4、(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列；
5、(2)如seq id no.2所示的氨基酸序列。
6、本专利技术还提供了靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如下述序列之一：
7、(1)如seq id no.3所示的核苷酸序列；
8、(2)如seq id no.4所示的核苷酸序列。
9、本专利技术还提供将上述靶向致病弧菌pira的单域抗体或编码基因在应用于制备用于对虾ahpnd病原检测的检测产品中。
10、作为本专利技术优选的一种具体实施方式，本专利技术提供一种对虾ahpnd病原的免疫检测试纸，所述检测试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸收垫和pvc底板组成，所述结合垫中包被胶体金标记的靶向致病弧菌pira的单域抗体，具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述检测线上包被靶向致病弧菌pira的单域抗体，具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；所述质控线上包被兔抗鲨二抗。
11、进一步地，标记靶向致病弧菌pira的单域抗体胶体金颗粒的粒径为14～22nm。
12、进一步地，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次相互重叠2mm固定于pvc底板上；所述检测线设置于硝酸纤维素膜靠近结合垫一侧，所述质控线设置于硝酸纤维素膜靠近吸收垫一侧。
13、本专利技术还提供一种基于鲨源单域抗体的对虾ahpnd病原检测方法，利用上述对虾ahpnd病原的免疫检测试纸测试对虾生物样品中pira毒素蛋白。
14、本专利技术的有益效果：
15、1、本专利技术构建了抗pira毒素蛋白单域抗体的噬菌体展示文库，并分别以pira不同区段的多肽序列筛选可结合pira不同抗原表位的单域抗体；本专利技术中筛选获得的两株单域抗体均可特异性识别pira毒素蛋白，并且与其他非特异性交叉反应性蛋白无特异性结合，本专利技术获得的单域抗体稳定性高、抗逆性强、特异性好，因而具备良好的应用价值。
16、2、本专利技术利用筛选获得的两株单域抗体制成胶体金免疫检测试纸，可以特异性检测pira毒素蛋白，提高了检测的稳定性和检测限，达到操作简便、价格经济的目的，养殖人员在养殖现场即可进行检测，适合于在养殖生产中推广应用，并且与其他对虾常见病害的病原，包括白斑综合征病毒(wssv)、虹彩病毒(div1)、造血组织坏死病毒(innhv)无交叉反应，假阳性率低，特异性强。
17、3、本专利技术为首次制备了ahpnd毒素蛋白的鲨源单域抗体，并将其应用于开发胶体金免疫检测试纸，不仅实现了ahpnd可视化检测，并且为单域抗体在在更多的水产病原的诊断和水产病害防治中的应用积累了经验，奠定了基础。
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1.一种靶向致病弧菌PirA毒素蛋白的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列如下述序列之一：
2.权利要求1所述的一种靶向致病弧菌PirA毒素蛋白的单域抗体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下述序列之一：
3.如权利要求1所述的靶向致病弧菌PirA毒素蛋白的单域抗体或如权利要求2所述的编码基因在制备用于对虾AHPND病原检测的检测产品中的应用。
4.一种对虾AHPND病原的免疫检测试纸，所述检测试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸收垫和PVC底板组成，其特征在于：所述结合垫中包被胶体金标记的靶向致病弧菌PirA的单域抗体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述检测线上包被靶向致病弧菌PirA的单域抗体，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述质控线上包被兔抗鲨二抗。
5.如权利要求4所述的一种对虾AHPND病原的免疫检测试纸，其特征在于：标记靶向致病弧菌PirA的单域抗体的胶体金颗粒的粒径为14～22nm。
6.如权利要求4所述的一种对虾AHPND病原的免疫
...【技术特征摘要】
1.一种靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列如下述序列之一：
2.权利要求1所述的一种靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下述序列之一：
3.如权利要求1所述的靶向致病弧菌pira毒素蛋白的单域抗体或如权利要求2所述的编码基因在制备用于对虾ahpnd病原检测的检测产品中的应用。
4.一种对虾ahpnd病原的免疫检测试纸，所述检测试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸收垫和pvc底板组成，其特征在于：所述结合垫中包被胶体金标记的靶向致病弧菌pir...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦霖，程云英，陈建明，张倩，甘凯武，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：
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