【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鹅膏肽类毒素检测，涉及一种生物检材中鹅膏肽类毒素的检测方法。
技术介绍
1、毒蕈在全世界分布广泛，种类繁多。中国毒蕈资源丰富，毒蕈多与可食用蘑菇形态类似，故误采误食是其主要的中毒原因。并且食物传统也导致毒蕈中毒有着区别于别地的高发区。在毒蕈中毒案例报道之中，鹅膏菌属约占90％以上。经检测鉴定鹅膏菌属中含有鹅膏肽类毒素，根据氨基酸组成与结构不同，可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素。其中毒性物质主要为α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽这5种。
2、目前国内外学者对5种鹅膏毒肽的研究主要集中在前处理方法和检测技术上，开发出了超声辅助溶剂提取法、固相萃取法、溶剂提取结合固相萃取法和quechers法。此类方法大多需要固相萃取小柱，所需相对较高的经济成本和时间成本。
3、因此，亟需建立一种生物检材中5种鹅膏毒肽：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽的前处理方法简单、所需检材量少、灵敏度高、回收率高的hplc-ms/ms检测方法，以便用于中毒案件生物检材中5种鹅膏毒肽的法医毒物检测分析，为此类中毒案件的侦破提供依据。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种生物检材中鹅膏肽类毒素的检测方法，基于蛋白沉淀-液质联用，实现了血浆和肝脏样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的检测。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术
3、1、一种生物检材中鹅膏肽类毒素的定性检测方法，所述的鹅膏肽类毒素为：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽；具体步骤如下：
4、(1)样品前处理：取空白生物基质，加内标，接着加入甲酸乙腈溶液沉淀蛋白，涡旋振荡，冰水浴超声，第一次离心取上清，氮气流吹干，初始流动相复溶，第二次离心取上清，0.22μm过滤膜过滤，得到前处理样品；
5、(2)采用超高效液相色谱串联质谱检测，检测条件如下：
6、液相条件为：流动相a相为5mmol/l的甲酸铵水溶液，b相为甲醇，流速为0.3ml/min，采用梯度洗脱模式，初始为体积百分数15％b，保持1.5min，随后在3.5min内线性升高到体积百分数45％b，接着在0.1min内升高到体积百分数95％b并维持1.9min，随后在0.1min内下降到体积百分数15％b并维持2.9min；
7、质谱条件为：选择两对离子对919.2→259.2/86.2、920.3→259.1/85.7、903.3→243.1/85.8、847.3→157.3/86.0、789.3→157.1/86.1分别对α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽进行定性；
8、(3)取生物检材，按照步骤(1)的前处理方法和步骤(2)的检测条件进行处理和检测，根据定性离子对保留时间，相对丰度比定性，判断生物检材中是否含有所述的鹅膏肽类毒素。
9、优选的，步骤(1)中，空白生物基质、内标、甲酸乙腈溶液、初始流动相的用量比为100μg(固态)或100μl(液态)：50μl：600μl：100μl；50μg/ml微囊藻毒素-rr甲醇溶液，甲酸乙腈溶液中所含甲酸的体积浓度为1％，涡旋震荡时间为30s，冰水浴超声时间为15分钟，第一次离心的工艺条件为：12000g，4℃离心10分钟，初始流动相是将5mmol/l甲酸铵水溶液与甲醇按照体积比85：15混合而得，第二次离心的工艺条件为：14000g，4℃离心10分钟。
10、优选的，步骤(1)中，所述生物基质为血浆或肝脏。
11、优选的，步骤(2)中，液相色谱柱选用agilent zorbax sb-c18(2.1×100mm,3.5μm)，柱温箱温度为30℃。
12、优选的，步骤(2)中，质谱采用esi源，正离子模式；雾化干燥气温度(tem)：300℃；离子喷雾电压(is)：4000v；气体流量(gasflow)：10l/min。
13、优选的，步骤(2)中，内标选择离子对为520.3→135.2/103.3/70.1。
14、2、一种生物检材中鹅膏肽类毒素的定量检测方法，所述的鹅膏肽类毒素为：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽；具体步骤如下：
15、(1)样品前处理：取空白生物基质，加内标，接着加入甲酸乙腈溶液沉淀蛋白，涡旋振荡，冰水浴超声，第一次离心取上清，氮气流吹干，初始流动相复溶，第二次离心取上清，0.22μm过滤膜过滤，得到前处理样品；
16、(2)采用超高效液相色谱串联质谱检测，检测条件如下：
17、液相条件为：流动相a相为5mmol/l的甲酸铵水溶液，b相为甲醇，流速为0.3ml/min，采用梯度洗脱模式，初始为体积百分数15％b，保持1.5min，随后在3.5min内线性升高到体积百分数45％b，接着在0.1min内升高到体积百分数95％b并维持1.9min，随后在0.1min内下降到体积百分数15％b并维持2.9min；
18、质谱条件为：选择离子对919.2→86.2、920.3→85.7、903.3→85.8、847.3→86.0、789.3→86.1分别作为α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽的定量离子对，根据定性离子对保留时间，相对丰度比定性，内标工作曲线法定量；
19、(3)配制各鹅膏肽类毒素的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液分别添加至空白生物基质中，按照步骤(1)的前处理方法和步骤(2)的检测条件进行处理和检测，以添加样品的终浓度为横坐标(x)，5种鹅膏毒肽与内标的峰面积之比为纵坐标(y)，得到其线性回归方程；
20、(4)取生物检材，按照步骤(1)的前处理方法和步骤(2)的检测条件进行处理和检测，按照步骤(3)的线性回归方程，根据内标工作曲线法定量，计算得到生物检材中各鹅膏肽类毒素的含量。
21、优选的，步骤(1)中，空白生物基质、内标、甲酸乙腈溶液、初始流动相的用量比为100μg(固态)或100μl(液态)：50μl：600μl：100μl；内标为50μg/ml微囊藻毒素-rr甲醇溶液，甲酸乙腈溶液中所含甲酸的体积浓度为1％，涡旋震荡时间为30s，冰水浴超声时间为15分钟，第一次离心的工艺条件为：12000g，4℃离心10分钟，初始流动相是将5mmol/l甲酸铵水溶液与甲醇按照体积比85：15混合而得，第二次离心的工艺条件为：14000g，4℃离心10分钟。
22、优选的，步骤(1)中，所述生物基质为血浆或肝脏。
23、优选的，步骤(2)中，液相色谱柱选用agilent zorbax sb-c18(2.1×100mm,3.5μm)，柱温箱温度为30℃。
24、优选的，步骤(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物检材中鹅膏肽类毒素的定性检测方法，其特征在于，所述的鹅膏肽类毒素为：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽；具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(1)中，空白生物基质、内标、甲酸乙腈溶液、初始流动相的用量比为100μg或100μL：50μL：600μL：100μL；内标为50μg/ml微囊藻毒素-RR甲醇溶液，甲酸乙腈溶液中所含甲酸的体积浓度为1％，涡旋震荡时间为30s，冰水浴超声时间为15分钟，第一次离心的工艺条件为：12000g，4℃离心10分钟，初始流动相是将5mmol/L甲酸铵水溶液与甲醇按照体积比85：15混合而得，第二次离心的工艺条件为：14000g，4℃离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物基质为血浆或肝脏。
4.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(2)中，液相色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18，柱温箱温度为30℃。
5.根据权利要求1所述的定性检测方法，其
6.一种生物检材中鹅膏肽类毒素的定量检测方法，其特征在于，所述的鹅膏肽类毒素为：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽；具体步骤如下：
7.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，空白生物基质、内标、甲酸乙腈溶液、初始流动相的用量比为100μg或100μL：50μL：600μL：100μL；内标为50μg/ml微囊藻毒素-RR甲醇溶液，甲酸乙腈溶液中所含甲酸的体积浓度为1％，涡旋震荡时间为30s，冰水浴超声时间为15分钟，第一次离心的工艺条件为：12000g，4℃离心10分钟，初始流动相是将5mmol/L甲酸铵水溶液与甲醇按照体积比85：15混合而得，第二次离心的工艺条件为：14000g，4℃离心10分钟。
8.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物基质为血浆或肝脏。
9.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，液相色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C18，柱温箱温度为30℃。
10.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱采用ESI源，正离子模式；雾化干燥气温度：300℃；离子喷雾电压：4000V；气体流量：10L/min。
...【技术特征摘要】
1.一种生物检材中鹅膏肽类毒素的定性检测方法，其特征在于，所述的鹅膏肽类毒素为：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽；具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(1)中，空白生物基质、内标、甲酸乙腈溶液、初始流动相的用量比为100μg或100μl：50μl：600μl：100μl；内标为50μg/ml微囊藻毒素-rr甲醇溶液，甲酸乙腈溶液中所含甲酸的体积浓度为1％，涡旋震荡时间为30s，冰水浴超声时间为15分钟，第一次离心的工艺条件为：12000g，4℃离心10分钟，初始流动相是将5mmol/l甲酸铵水溶液与甲醇按照体积比85：15混合而得，第二次离心的工艺条件为：14000g，4℃离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物基质为血浆或肝脏。
4.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(2)中，液相色谱柱选用agilent zorbax sb-c18，柱温箱温度为30℃。
5.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱采用esi源，正离子模式；雾化干燥气温度：300℃；离子喷雾电压：4000v；气体流量：10l/min。
...【专利技术属性】
技术研发人员：崔海燕，师燕华，郭月，胡萌，王乐乐，王涛，尉志文，贠克明，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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