【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学，尤其涉及c-肽抗原表位肽组合物、抗体组合以及测定人c-肽的试剂盒。
技术介绍
1、人c-肽是由31个氨基酸组成的单链多肽，分子量约为3021道尔顿，c-肽是胰岛素生物合成过程中胰岛素原裂解成为胰岛素的伴随产物，胰岛素原储存在胰腺细胞高尔基复合体的分泌颗粒中，由前胰岛素原裂解产生。
2、人胰岛素原是由86个氨基酸组成的多肽，主要由第1至第30氨基酸构成的胰岛素b链，第33至第63氨基酸构成的c-肽和第66至第86氨基酸构成的胰岛素a链构成。c-肽通过第31个氨基酸精氨酸(arg)和第32个氨基酸arg与胰岛素b链结合，并通过第64个氨基酸赖氨酸(lys)和第65个氨基酸arg与胰岛素a链结合(见图1)。当胰岛素原分解时，c-肽与胰岛素等摩尔量分泌于血清中，c-肽在体内清除率慢，几乎不被肝脏摄取，而胰岛素易被肝脏降解，且c-肽检测不受外源胰岛素和胰岛素抗体的影响，因此，c-肽是用于研究患有糖尿病的患者中分泌内源性胰岛素的能力的重要指标。c-肽的测量，用于糖尿病的诊断和治疗，并且可用于胰岛素瘤和胰岛素自身免疫综合征的诊断。此外，c-肽含量的测定还可以用于区分ⅰ型和ⅱ型糖尿病；可以判断胰岛素治疗患者的胰岛功能；可以鉴定低血糖发生原因、有助于胰岛细胞瘤的诊断及手术效果判断；还可以根据血液中c-肽和胰岛素比值判定肝肾疾病。
3、通常，健康人空腹状态时，胰岛素原和裂解产物的浓度比c-肽低100倍，因此交叉反应对临床不造成明显影响。但有报道胰岛素瘤的患者其胰岛素原的浓度可达正常人空腹状态的60倍(ho
4、目前临床上用于检测c-肽的方法主要有放射免疫分析(ria)、酶联免疫分析(elisa)、时间分辨荧光免疫分析(trfia)和化学发光免疫分析(clia)等。ria的放射性标签会危害人员身体健康，需要处理放射性废物。此外，放射性元素的半衰期是储存寿命的限制因素，导致其灵敏度和抗干扰能力差。而elisa具有重复性差，灵敏度低，线性范围窄且易受基质效应影响、并且不易实现全自动化等缺点，限制了其使用范围。trfia分析方法，会受到激发光的杂散光影响，导致灵敏度受到限制。clia比其它分析方法灵敏度高、特异性高、操作简单、线性范围广、分析快速，同时，化学发光(cl)的光强度在加入底物后的1-2分钟内达到最大值，因此与常规方法相比，缩短了整个分析过程。目前，市售的试剂盒包括罗氏、雅培、西门子等都与胰岛素原有不同程度的交叉，其中罗氏试剂说明书声称与100ng/ml人胰岛素原交叉率为32.5％、雅培试剂说明书声称10ng/ml人胰岛素原交叉率为12.8％、西门子试剂说明书声称与1.25ng/ml人胰岛素原有3.4％的交叉率。市售试剂盒大多数采用鼠单抗(两株抗体均同胰岛素原有交叉)，胰岛素原交叉率较高，特异性不强。而现有报道的c-肽化学发光检测方法大多解决不了与胰岛素原的交叉反应。例如，日本专利(kokoku)no.57-44663公开了使用放射性标记的c-肽的竞争免疫测定法；日本公开专利(kokai)no.1-165962公开了使用c-肽的竞争免疫测定法。日本公开专利(kokai)no.4-177166公开了一种使用单克隆抗体测量c-肽的夹心免疫测定法；欧洲专利局(kitajima)ep1191337a2公开使用一种测量c-肽的夹心免疫测定的方法，从medix biochemica商购的抗人c-肽单克隆抗体9101和从dako商购的抗人c-肽单克隆抗体cpt-3-f11，两株鼠单抗建立检测系统。两株鼠单抗分别识别n端第1至10和第1-16氨基酸残基的区域表位，存在部分重叠。其专利技术声称该试剂与人胰岛素原测交叉率≥0.4％，但该试剂经本专利技术人验证，其交叉率达到5％左右。
5、综上，目前市售的免疫方法检测c-肽试剂特异性不高，主要是同胰岛素原的交叉反应性高。到目前为止，市售试剂及公开的报道中，尚不存在同胰岛素原完全无交叉反应性的免疫学方法，因此，亟需开发出与胰岛素原无交叉反应的人c-肽免疫检测系统。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种测量人c-肽的免疫测定方法，本专利技术的独特之处在于采用两种识别不同抗原表位的抗体形成双抗体夹心免疫复合物，使得免疫测定具有优越的再现性和特异性。
2、本专利技术提供一种抗原表位肽组合物，包括人c-肽第19至31位氨基酸所示的抗原表位肽1和第3至8位氨基酸所示的抗原表位肽2。
3、抗人c-肽抗体组合，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽1和载体蛋白免疫动物制得，所述第二抗体由所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽2和载体蛋白免疫动物制得。
4、本专利技术中，将载体蛋白和抗原表位肽藕连得到免疫原。本专利技术对载体蛋白的种类没有特殊要求，为本领域制备免疫原常用的种类即可，如klh、bsa等等。
5、本专利技术提供了所述的抗原表位肽组合物、所述的抗人c-肽抗体组合在制备c-肽检测试剂盒中的应用。
6、本专利技术提供一种测定c-肽的试剂盒，包括：标记物标记的第一抗体和包被有第二抗体的固相载体混悬液；
7、所述第一抗体识别人c-肽第19至31位氨基酸所示的抗原表位；
8、所述第二抗体识别人c-肽第3至8位氨基酸所示的抗原表位。
9、人c-肽是由31个氨基酸组成的单链多肽，其氨基酸序列如图1所示，c-肽的结构完全包含在胰岛素原的结构中，造成大部分抗体不能识别c-肽和胰岛素原的结构差异，但c-肽末端暴露区域与人胰岛素原的相应区域的结构或电学条件不同。本专利技术人经过深入研究，提供一种能够特异性测定人c-肽的夹心免疫测定试剂盒。该试剂盒使用的第一人c-肽抗体，该抗体识别人c-肽c末端表位(即n端第19至31个氨基酸序列)；第二人c-肽抗体，其固定在固相载体上并识别存在于从人c-肽的n末端的第3至8个氨基酸残基的区域表位；两抗体识别不同末端表位且不存在重复区域的第一抗体和第二抗体，使得它们可以同时结合人c-肽，而第一人c-肽抗体能够特异性识别人c-肽c末端位点，有效地避免了与人胰岛素本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗原表位肽组合物，其特征在于，包括人C-肽第19至31位氨基酸所示的抗原表位肽1和第3至8位氨基酸所示的抗原表位肽2。
2.抗人C-肽抗体组合，其特征在于，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体由权利要求1所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽1和载体蛋白免疫动物制得，所述第二抗体由权利要求1所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽2和载体蛋白免疫动物制得。
3.权利要求1所述的抗原表位肽组合物、权利要求2所述的抗人C-肽抗体组合在制备C-肽检测试剂盒中的应用。
4.一种测定C-肽的试剂盒，其特征在于，包括：标记物标记的第一抗体和包被有第二抗体的固相载体混悬液；
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为特异性识别C-肽的兔单克隆抗体，所述第二抗体为鼠单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体混悬液的缓冲液为含BSA、叠氮化钠、ProClin300、蛋白保护剂、EDTA-2K的BIS-TRIS propane缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为放射性同位素，所述放射性同位素包括125碘或131碘。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为酶，所述试剂盒还包括底物；所述酶包括过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶；所述底物包括鲁米诺、邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基磷酸酯或AMPPD(3-[4-甲氧基螺[(1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-三环[3,3]、1,1,3,7]癸烷)-4-基]苯基磷酸酯)。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为荧光物质，所述荧光物质包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺衍生物。
11.根据权利要求4～10任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括C-肽校准品，所述C-肽校准品的浓度为0～30ng/mL范围内的多个浓度。
12.根据权利要求4～11任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括浓缩洗液；所述浓缩洗液为含有2wt％Tween20、1wt％Proclin300的pH 7.5、2mol/L的磷酸盐缓冲液。
13.一种非诊断目的的测定C-肽的方法，其特征在于，利用权利要求4～12任一项所述的试剂盒对样本中的C-肽含量进行检测。
...【技术特征摘要】
1.抗原表位肽组合物，其特征在于，包括人c-肽第19至31位氨基酸所示的抗原表位肽1和第3至8位氨基酸所示的抗原表位肽2。
2.抗人c-肽抗体组合，其特征在于，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体由权利要求1所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽1和载体蛋白免疫动物制得，所述第二抗体由权利要求1所述抗原表位肽组合物中的抗原表位肽2和载体蛋白免疫动物制得。
3.权利要求1所述的抗原表位肽组合物、权利要求2所述的抗人c-肽抗体组合在制备c-肽检测试剂盒中的应用。
4.一种测定c-肽的试剂盒，其特征在于，包括：标记物标记的第一抗体和包被有第二抗体的固相载体混悬液；
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为特异性识别c-肽的兔单克隆抗体，所述第二抗体为鼠单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体混悬液的缓冲液为含bsa、叠氮化钠、proclin300、蛋白保护剂、edta-2k的bis-tris propane缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括：磁微粒、微球，或由聚苯乙烯、聚乙烯、琼脂糖或纤维素制成的载体材料；
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【专利技术属性】
技术研发人员：张跃峰，张涛，陈垭玮，宋巧丽，陶慧娟，刘利芳，田晓平，李笑颜，刘功成，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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