【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体涉及一种基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统及其应用。
技术介绍
1、细菌和古细菌中的crispr-cas(规则间隔的短回文重复序列-crispr相关)系统是抵御外源性遗传元件入侵的适应性免疫系统。根据其构成和功能，它们被分为i类和ii类。目前广泛应用于真核基因组编辑的有效rna导向工具，如ii型cas9、v型cas12a和vi型cas13a，都源自i类单个亚基效应器，而后者仅占所有crispr-cas系统的约10％。然而，占据约90％的i类多亚基效应器复合物尚未被广泛开发为哺乳动物基因组编辑工具。
2、i型crispr-cas系统是i类crispr系统中最丰富多样的一群。根据cas操纵子的组成，i型系统可以进一步分为i-a到i-g几个亚型。一般而言，i型crispr系统由三部分组成：引导的crispr rna(crrna)、靶向识别模块级联复合物(cascade)和dna剪切模块通常为cas3解旋核酸酶。cascade首先在crrna的引导下识别并结合到5'端邻近基序(pam)相邻的靶点序列，然后形成稳定的r环，触发cascade构象变化从而招募cas3解旋核酸酶，从而降解靶向dna。
3、与常用的单一效应器crispr系统相比，i型crispr系统具有独特特征。首先，不同于cas9和cas12a产生的小片段的缺失和插入，i型crispr-cas系统总是会剪切dna靶点并引发大片段缺失。其次，在i型crispr系统中，crrna的靶向识别长度约30个碱基或更长。该特征
4、最近，有几个i型crispr系统已成功应用于操纵哺乳动物细胞基因组。包括源自大肠杆菌的i-e型cascade与foki核酸内切酶融合，用于引发靶点突变；来自大肠杆菌的i-e系统，可在人细胞中实现定向和大范围的dna降解；来自铜绿微芽胞的i-d crispr系统，可在植物细胞中实现双向大片段的缺失以及小片段的插入和缺失；来自链球菌灭活木霉、大肠杆菌、绿脓杆菌和臭味沙雷氏菌的i-e、i-f和i-fv系统，用于调控植物和人类基因表达。所有这些系统都需要同时过度表达多个组分才能发挥功能。i型crispr系统的复杂性和相对较大的负载尺寸阻碍了它们的广泛应用。因此，探索和简化微型i型crispr-cas系统将为基因组编辑和基因调控提供新的工具。
5、在细菌中，较精简的i-c型crispr系统仅需要三种独特蛋白就可形成dna靶向cascade复合物。而在哺乳动物细胞中安全结合靶向dna时，cascade中的cas11c亚基是必需的。来自奈瑟淋球菌、高盐芽孢杆菌(bha)和脱硫弧菌(dvu)的几种i-c系统已被用于哺乳动物细胞基因编辑。然而，它们会引发无控制的大片段异质性dna缺失，可能造成破坏性影响。之前报道的来自脱硫弧菌的i-c系统显示出相对较低的dna切割活性。但尚未被充分探索。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统及其应用，以解决现有i-c型crispr系统用于哺乳动物细胞基因编辑可能会引发大片段异质性dna缺失，造成破坏性影响的问题。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、一种基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统，包括crispr rna、i-c型编辑器piggybac载体和dna剪切模块；i-c型编辑器piggybac载体包括cascade组件、cas3蛋白及puro抗性基因。
4、进一步地，cascade组件由cas5c蛋白、cas7c蛋白、cas8c蛋白和cas11c蛋白复合而成，通过不同的2a肽连接，受同一cmv启动子调控。
5、进一步地，cas5c蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示，cas7c蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示，cas8c蛋白的核苷酸序列如seq id no.3所示，cas11c蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6、进一步地，cas7c蛋白和所述cas5c蛋白之间通过f2a连接，f2a的核苷酸序列如seqid no.5所示；cas5c和所述cas8c之间通过t2a连接，t2a的核苷酸序列如seq id no.6所示，cas8c和所述cas11c之间通过e2a连接，e2a的核苷酸序列如seq id no.7所示。
7、进一步地，所述cas5c蛋白、cas7c蛋白、cas8c蛋白和cas11c蛋白n端连接有bpnls；bpnls的核苷酸序列如seq id no.8所示；
8、进一步地，cas3蛋白的核苷酸序列如seq id no.9所示，cas3蛋白的n端连有bpnls，bpnls的核苷酸序列如seq id no.8所示，cas3蛋白的c端连有核质蛋白nl s，核质蛋白nls的核苷酸序列如seq id no.10所示。
9、上述基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统用于识别、结合及编辑哺乳动物基因中的应用。
10、一种用于识别、结合及编辑哺乳动物基因的试剂盒，包括上述的基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统。
11、本专利技术具有以下有益效果：
12、本专利技术对来自脱硫弧菌(desulfovibrio vulgaris)的一种i-c型crispr系统进行了优化，并证明了它在哺乳动物细胞和动物中能够进行精确高效基因组编辑和碱基编辑。利用优化的编辑器和成对的pam内向的crrnas，本专利技术在人类和猪细胞系的多个内源位点实现了定义性的缺失。这与先前引起不受控制和杂合的编辑的i型系统形成对比。本专利技术的结果表明，cas复合物的对向定位最有可能阻碍了连续核酸酶活性，从而实现了靶位点之间的限制性切割。此外，利用同源依赖性修复途径，内源dna可以通过成对pam-in crrna精确替换。本专利技术还证明了这一平台在原代猪成纤维细胞中的功效，这些修饰后的猪原代成纤维细胞可成功用作供体细胞来克隆含有cd163srcr5结构域缺失的基因工程猪。这凸显了该工具在农业应用中的潜力。
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1.一种基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统，其特征在于：包括CRISPR RN A、I-C型编辑器piggyBac载体和DNA剪切模块；所述I-C型编辑器piggyBac载体包括Cascade组件、Cas3蛋白及Puro抗性基因。
2.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统，其特征在于，所述Cascade组件由Cas5c蛋白、Cas7c蛋白、Cas8c蛋白和Cas11c蛋白复合而成，通过不同的2A肽连接，受同一CMV启动子调控。
3.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统，其特征在于，所述Cas5c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Cas7c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Cas8c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas11c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统，其特征在于，所述Cas7c蛋白和所述Cas5c蛋白之间通过F2A连接，所述F2A的核苷酸序列
5.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统，其特征在于，所述Cas5c蛋白、Cas7c蛋白、Cas8c蛋白和Cas11c蛋白N端连接有BPNLS；BPNLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR系统，其特征在于，所述Cas3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Cas3蛋白的N端连有BPNLS，BPNLS的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，Cas3蛋白的C端连有核质蛋白NLS，核质蛋白NLS的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
7.权利要求1-6任一项所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统用于识别、结合及编辑哺乳动物基因中的应用。
8.一种用于识别、结合及编辑哺乳动物基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的基于脱硫弧菌I-C型CRISPR基因编辑系统。
...【技术特征摘要】
1.一种基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统，其特征在于：包括crispr rn a、i-c型编辑器piggybac载体和dna剪切模块；所述i-c型编辑器piggybac载体包括cascade组件、cas3蛋白及puro抗性基因。
2.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统，其特征在于，所述cascade组件由cas5c蛋白、cas7c蛋白、cas8c蛋白和cas11c蛋白复合而成，通过不同的2a肽连接，受同一cmv启动子调控。
3.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统，其特征在于，所述cas5c蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cas7c蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cas8c蛋白的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cas11c蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.根据权利要求1所述的基于脱硫弧菌i-c型crispr基因编辑系统，其特征在于，所述cas7c蛋白和所述cas5c蛋白之间通过f2a连接，所述f2a的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述cas5c...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴森，李攀，杜旭光，董鼎才，高菲，谢宇洋，黄泓林，孙思维，马昭，何诚，赖锦盛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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