【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料领域，具体涉及一种具有椎间盘退变微环境乳酸响应和mirna智控递送功能的微凝胶体系。
技术介绍
1、椎间盘退变(ivdd)是导致慢性下腰痛的主要原因，主要是由椎间盘(ivd)髓核内持续的炎症引起的。髓核的功能依赖于其富含ⅱ型胶原(col ii)和蛋白聚糖(acan)的细胞外基质(ecm)。ivdd的进展特征是ecm中合成代谢和分解代谢过程的失衡，这一过程由加剧的炎症反应和通过基质金属蛋白酶(mmps)金属蛋白酶域蛋白(adamts)引起的ecm降解。这种ecm降解，加之酸性炎症环境的作用，导致髓核细胞(npcs)过度凋亡和ecm合成受阻加剧了ivdd的发展。
2、目前已有报道mir-155在退变椎间盘髓核细胞中明显下调，但未有mir-155-5p治疗ivdd的相关报道，且mirna治疗ivdd仍受稳定性差、缺乏靶向性和递送效率低等阻碍。
3、为了克服这些问题，目前研究探索了使用外泌体、阳离子聚合物和脂质体等非病毒纳米载体进行mirna运输。然而，这些载体仍面临诸如mirna装载量低、稳定性有限和潜在的免疫原性等问题，特别是在退变椎间盘这样的炎症微环环境中。
4、透明质酸(ha)是椎间盘ecm的固有成分，可以通过cd44受体有效地靶向结合npcs，这表明了其具有用于mirna靶向递送的潜力。尽管如此，这并未解决由线粒体功能障碍，活性氧(mtros)积聚引起的慢性炎症问题，这对线粒体功能不利，并在npcs中加剧了氧化应激反应。
5、ss-31肽(多肽ss31)是一
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种乳酸响应微凝胶体系通过控制释放mirna治疗退变的椎间盘变。
2、本专利技术提供了一种具有椎间盘退变微环境乳酸响应和mirna智控递送功能的微凝胶体系，其是由内核和外壳构成；所述内核是负载了mirna的纳米凝胶与甲基丙烯酸化明胶微凝胶复合而成的复合体；所述外壳是壳聚糖；
3、所述纳米凝胶是ss31多肽和氧化透明质酸通过席夫碱反应而成的，经氨基环糊精修饰的纳米凝胶；
4、所述ss31多肽的氨基酸序列为：d-arg-dmt-lys-phe-nh2；
5、所述甲基丙烯酸化明胶微凝胶是以含甲基丙烯酸化明胶和光引发剂的pbs缓冲液为水相，以液体石蜡和span80为油相，通过微流控技术交联而成的，经nspp多肽修饰的微凝胶；
6、所述nspp多肽是具有mmp靶点的多肽，其氨基酸序列为gplglagc；
7、所述甲基丙烯酸化明胶微凝胶与纳米凝胶的质量体积比为5mg：50～150μl。
8、进一步地，所述内核和外壳通过浸泡的方式组装；每2～10mg内核浸泡于2～8℃外壳溶液中60min。
9、进一步地，所述纳米凝胶的制备方法包括如下步骤：
10、取溶解有氨基环糊精和ss31多肽的pbs缓冲液，与溶解有氧化透明质酸的pbs缓冲液混合反应，反应完全后透析，过滤，即得。
11、更进一步地，所述ss31肽、氧化透明质酸和氨基环糊精的质量比为8～12：8～12：3～6，优选10：10：4；所述氧化透明质酸中醛基比例为35～50％，优选45％。
12、更进一步地，所述纳米凝胶负载mirna的方法包括如下步骤：
13、取纳米凝胶与mirna混合，混合物加入到hepes缓冲液中反应，反应完全后透析，即得。
14、更进一步地，所述纳米凝胶和mirna的质量比为5：1。
15、更进一步地，所述mirna包括mir-155，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
16、进一步地，所述甲基丙烯酸化明胶微凝胶的制备方法包括如下步骤：
17、1)取甲基丙烯酸化明胶和光引发剂溶解于pbs缓冲液，得水相；取石蜡油和span80混合，得油相；
18、2)流动的油相与流动的水相混合，光交联后用水洗净，得微凝胶；
19、3)取步骤2)所得微凝胶，在溶有nspp肽的pbs溶液中孵育，干燥，即得。
20、更进一步地，步骤1)所述甲基丙烯酸化明胶、光引发剂、pbs缓冲液、石蜡油和span80的质量体积比为250mg：25mg：5ml：30g：1.2g；所述光引发剂为锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸盐；所述甲基丙烯酸化明胶中甲基丙烯酸的接枝比率为35-40％，优选38.50％。
21、和/或：步骤2)所述油相的流速为100μl/min，水相的流速为10μl/min；光交联的波长为405nm，时间15分钟；
22、和/或：步骤3)所述nspp肽和pbs溶液的质量体积比为10mg：5ml；所述pbs溶液的体积与步骤1)中pbs溶液等量；所述孵育的时间为6小时。
23、本专利技术还提供了一种制备前述退变椎间盘修复微凝胶体系的方法，包括如下步骤：
24、①取负载了mirna的纳米凝胶和甲基丙烯酸化明胶微凝胶混合孵育至完全吸收，得复合体；取壳聚糖溶解于乳酸中，得壳聚糖溶液；
25、②取复合体加入壳聚糖溶液中，浸泡，洗涤，透析，再洗涤后，即得；
26、所述壳聚糖溶液的浓度为1％，浸泡的温度为4℃，时间为60分钟；所述洗涤是用pbs缓冲液洗涤；所述透析是在ph值8.0的碳酸盐缓冲液中渗透60分钟；透析后洗涤至微凝胶ph值7.4-7.5。
27、本专利技术最后提供了一种前述退变椎间盘修复微凝胶体系在制备治疗椎间盘退变的药物中的用途。
28、本专利技术通过席夫碱反应将ss31多肽与氧化透明质酸(oha)连接，得到了一种具有乳酸响应的纳米凝胶体系，该纳米凝胶通过氨基环糊精(cd-nh2)修饰，通过主-客相互作用包裹mir-155，用于递送mir-155，为ivdd治疗提供了一种新方法。这种新型基于纳米凝胶的mir-155递送载体ngm特异结合npcs的cd44上，进而实现精确靶向npcs和控制释放的能力，同时多肽ss31靶向线粒体，稳定线粒体膜电位并减少mtros，增强atp产生，维持了线粒体功能。该纳米凝胶是一种既能递送mirna又能同时减轻mtros产生的双重功能载体。
29、然而，ivdd的常见病理特征是细胞外乳酸的积累，这种积累干扰mirna传递，并通过asic3激活nlrp3/caspase-1/il-1β炎症级联反应，导致炎性衰老。ngm对乳酸的敏感性使其可能过早降解，不利于应用于ivdd治疗，因此，需要进一步开发以确保控制释放。
30、本专利技术开拓性的将ngm与甲基丙烯酸化明胶(gelma)微凝胶复合，通过gelma中对金属蛋白酶mmp敏感的nspp多肽将ngm捕获，形成了一个微纳复合体(gngm)。为了缓解酸性iv本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有椎间盘退变微环境乳酸响应和miRNA智控递送功能的微凝胶体系，其特征在于：其是由内核和外壳构成；所述内核是负载了miRNA的纳米凝胶与甲基丙烯酸化明胶微凝胶复合而成的复合体；所述外壳是壳聚糖；
2.根据权利要求1所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶的制备方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述SS31多肽、氧化透明质酸和氨基环糊精的质量比为8～12：8～12：3～6，优选10：10：4；所述氧化透明质酸中醛基比例为35～50％，优选45％。
4.根据权利要求1～3任一项所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶负载miRNA的方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶和miRNA的质量比为5：1。
6.根据权利要求1、4或5所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述miRNA包括miR-155，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1所述的
8.根据权利要求7所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：步骤1)所述甲基丙烯酸化明胶、光引发剂、PBS缓冲液、石蜡油和Span80的质量体积比为250mg：25mg：5mL：30g：1.2g；所述光引发剂为锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸盐；所述甲基丙烯酸化明胶中甲基丙烯酸的接枝比率为35-40％，优选38.50％。
9.一种制备权利要求1～8任一项所述退变椎间盘修复微凝胶体系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
10.权利要求1～8任一项所述退变椎间盘修复微凝胶体系在制备治疗椎间盘退变的药物中的用途的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种具有椎间盘退变微环境乳酸响应和mirna智控递送功能的微凝胶体系，其特征在于：其是由内核和外壳构成；所述内核是负载了mirna的纳米凝胶与甲基丙烯酸化明胶微凝胶复合而成的复合体；所述外壳是壳聚糖；
2.根据权利要求1所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶的制备方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述ss31多肽、氧化透明质酸和氨基环糊精的质量比为8～12：8～12：3～6，优选10：10：4；所述氧化透明质酸中醛基比例为35～50％，优选45％。
4.根据权利要求1～3任一项所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶负载mirna的方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的退变椎间盘修复微凝胶体系，其特征在于：所述纳米凝胶和mirna的质量比为5：1。
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭川，孔清泉，王玉，马飞，刘驭横，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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