【技术实现步骤摘要】
本公开属于生物。具体涉及一种新型自复制rna(sarna)递送系统，该系统由病毒囊膜蛋白(e)组装形成的微囊泡介导sarna递送，并通过sarna自复制特点实现目的蛋白的靶向表达。
技术介绍
1、经过多年来的技术积累，基因治疗产业已经逐步走向成熟，引领着生物医药的第三次产业革命。其中，mrna药物作为相对安全的制剂，吸引了国内外研究者们的目光。其通过刺激免疫系统作出反应或表达产生相应蛋白来达到治疗目的，因此，下游的蛋白表达水平与治疗效果密切相关。传统mrna的缺点之一是它们不够稳定、易降解，导致下游的蛋白表达是非持续的。如果长期用于疾病治疗，可能需要患者注射大量的mrna制剂，这可能会增加mrna治疗的毒副作用。自我扩增rna(self-amplifying rna，sarna)是指以自己的rna序列作为模板，在其携带的rna聚合酶(rdrp)的辅助下进行自我复制的核酸序列。sarna的主要优点是其可以在很低的剂量下达到与大量传统mrna相同的蛋白表达水平，且可以持续产生目的蛋白。这一特点可以减少rna制剂治疗中的注射剂量和频率的同时，延长治疗效果，同时减少rna和给药载体可能产生的潜在毒副作用。
2、此外，mrna制剂的高效递送问题一直是困扰基因药物和基因治疗行业发展的重要瓶颈之一。目前，人类基因治疗所用递送载体，主要是包括脂质体、阳离子多聚物、纳米颗粒等的非病毒类和包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒的病毒类。非病毒类递送载体具备安全、稳定等特性，但其转染效率通常较低、生产成本较高，且副作用较为明显。病毒类递送载体，包
3、病毒e蛋白可以依赖于其c末端的信号肽和负电荷区域进行组装，形成病毒颗粒的包膜结构。在病毒的生命周期中，病毒e蛋白与其他病毒组件，如核蛋白、基质蛋白等，相互作用包装出具有感染性的病毒颗粒。这种病毒复制、包装产生子代病毒的过程，完全依赖于病毒核蛋白、基质蛋白等病毒结构蛋白的存在，当病毒基因组缺失核蛋白、基质蛋白等结构基因时，通常无法产生子代病毒颗粒。
4、rna与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，rna和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步，目前科研人员已经鉴定了较多rna上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的rna结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。病毒e蛋白是病毒囊膜上的主要膜蛋白，不仅仅介导了病毒与细胞受体的结合，而且在病毒包膜形成过程中有重要作用。
5、因此，如何发掘病毒e蛋白与mrna的相关作用潜能，利用病毒e蛋白的特点并结合sarna的安全高效性开发新的mrna药物递送系统，及开发新的更成熟的mrna药物制剂，需要本领域技术人员进一步探究。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种新型sarna递送(vrv)系统及其构建方法。通过两质粒转染系统，将sarna序列和病毒囊膜蛋白rna序列导入细胞，便可有效包装出含有sarna的细胞微囊泡递送系统，用于包装和递送sarna，并通过sarna实现目的蛋白的表达，这种新形式的递送系统极大地拓展了基因药物递送的方式。
2、为了实现上述目的，本公开的技术方案如下：
3、在一方面，本公开提供了一种构建sarna微囊泡递送系统的方法，包括以下步骤：
4、(1)设计sarna表达载体1和膜蛋白表达载体2；
5、(2)向宿主细胞内共转染表达载体1和表达载体2；
6、(3)培养宿主细胞，分离得到包含sarna的微囊泡；
7、其中，所述sarna中包含目的基因序列；
8、所述sarna表达载体中的复制子为甲病毒复制子；
9、所述微囊泡不含有衣壳蛋白。
10、在另一方面，本公开提供了一种前述方法制备的微囊泡递送载体，其中，所述递送载体包括表面镶嵌病毒膜蛋白的微囊泡和囊泡内包装的sarna，所述微囊泡不含有衣壳蛋白；优选地，所述sarna中还含有目的基因序列。
11、在另一方面，本公开提供了一种稳定表达前述微囊泡递送载体的细胞。
12、在另一方面，本公开提供了利用前述于方法、微囊泡递送载体和/或细胞在制备靶向药物中的用途。
13、在另一方面，本公开提供了利用前述于方法、微囊泡递送载体和/或细胞在制备疫苗制剂中的用途。
14、本公开所取得的有益效果至少如下：
15、本公开通过对sarna与病毒膜蛋白相互作用的研究，发现病毒e蛋白可以和sarna相互作用，并且在哺乳动物细胞中病毒e蛋白可以高效介导含有sarna的细胞微囊泡的产生。这种相互作用可能依赖于病毒e蛋白的特殊的跨膜区和胞内区蛋白三级结构，以及sarna的三级结构，当不存在病毒膜蛋白时，虽然细胞也可以自发产生细胞外囊泡，但并不能将sarna有效包装到囊泡中；同时，不同的病毒e蛋白与sarna相互作用的效果存在一定差异，产生的包装sarna的微囊泡的效率也不同，优化病毒e蛋白rna序列及sarna序列可有效促进病毒e蛋白与sarna相互作用，从而大幅提高包装sarna的微囊泡的生产效率。
16、本公开通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建saRNA微囊泡递送系统的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述膜蛋白为病毒膜蛋白；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目的基因是治疗基因或抗原基因；
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
5.权利要求1-4任一项所述的方法制备的微囊泡递送载体，其中，所述递送载体包括表面镶嵌病毒膜蛋白的微囊泡和囊泡内包装的saRNA，所述微囊泡不含有衣壳蛋白；
6.根据权利要求5所述的微囊泡递送载体，其中，所述微囊泡是由病毒囊膜蛋白和脂质双分子层组装的双层膜结构的囊泡状小体。
7.根据权利要求5或6所述的微囊泡递送载体，其中，所述微囊泡的粒径约为10nm-1000nm；
8.稳定表达权利要求5-7任一项所述的微囊泡递送载体的细胞。
9.权利要求1-4任一项所述的方法、权利要求5-7任一项所述的微囊泡递送载体和/或权利要求8所述的细胞在制备靶向药物中的用途。
10.权利要求1-4任一项所述的方法、权利要求5-
...【技术特征摘要】
1.一种构建sarna微囊泡递送系统的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述膜蛋白为病毒膜蛋白；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目的基因是治疗基因或抗原基因；
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；
5.权利要求1-4任一项所述的方法制备的微囊泡递送载体，其中，所述递送载体包括表面镶嵌病毒膜蛋白的微囊泡和囊泡内包装的sarna，所述微囊泡不含有衣壳蛋白；
6.根据权利要求5所述的微囊泡递送载体，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：张波，刘俊生，占顺利，
申请(专利权)人：浙江自贸区红岸基地生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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