【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外核酸检测领域，特别涉及引物和探针组合物、试剂盒及在检测emx1、chfr基因甲基化中的应用。
技术介绍
1、肝癌是最常见的人类肿瘤之一，肝癌可分为原发性和转移性两大类，原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hcc）、肝内胆管癌（cca）和混合型肝细胞癌-胆管癌（chcc-cca）三种不同病理学类型。肝细胞癌(hcc)约占原发性肝癌的75%。
2、hcc的早期诊断对于早期干预和生存至关重要。多项研究表明，早期监测可能会提高总体生存率，国际指南建议肝硬化患者应接受hcc筛查，因为肝硬化患者每年发生hcc的风险在2-4%之间。美国肝病协会 (aasld) 将以下患者归类为发生 hcc 的高风险患者：肝硬化患者（child pugh a期和b期）、肝硬化患者（child pugh c期等待肝移植）以及患者无肝硬化但患有 hbv。
3、aasld（美国肝病研究协会）目前建议高危患者每六个月接受一次腹部超声监测检测。然而，只有不到五分之一的高危患者接受 hcc 筛查。此外，腹部超声检测早期 hcc的敏感性仅为45% ，使用afp生物标志物检测进行额外筛查可能会提高hcc检出率，afp是一种血清糖蛋白，其升高与肝脏恶性肿瘤相关，即使使用组合方法，检测hcc的敏感性约为63%。磁共振成像(mri)和计算机断层扫描(ct)诊断hcc的总灵敏度分别为65%和72%。然而，对于小于2 cm的hcc, ct和mri的敏感性分别仅为48%和62%，而对于小于1 cm的hcc，ct和mri的敏感性更低。
4、肝活
5、目前正在研究大量候选标记物，其中，cfdna甲基化是一种有前景的标记物，dna甲基化为dna化学修饰的一种形式，在基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价结合一个甲基基团；能够在不改变dna序列的前提下，影响表达、基因与蛋白质互作等；一般来说，cfdna来源于死细胞，例如白细胞，但在癌症患者中，由于肿瘤细胞坏死或凋亡，肿瘤本身也可以将一小部分cfdna释放到循环中。可以分析这种循环肿瘤来源的 dna (ctdna)，以了解肿瘤特有的基因甲基化模式。研究表明，某些肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤发生早期即可出现，可作为诊断和监测的特异性标志物。事实上，对cfdna中全基因组图谱的比较揭示了对肿瘤具有特异性的高甲基化或低甲基化基因标记物（称为 dna 甲基化标记物 (dmm)），因此可以准确区分早期hcc和肝硬化。
6、在众多检测甲基化的方法中，高效、快速、操作简便的实时荧光定量pcr是主要方法之一。目前，临床一线缺乏准确性高的无创的肝细胞癌辅助诊断技术，开发基于基因甲基化检测的的产品，用于肝癌辅助诊断成为必要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出引物和探针组合物、试剂盒及在检测emx1、chfr基因甲基化中的应用，实现高灵敏性、高特异性、准确快速检测以适用于肝细胞癌辅助诊断。
2、在前期位点筛选工作中，我们通过224例肝癌临床样本和276例正常人样本的血浆样本进行rrbs甲基化位点检测，同时参考了公共数据库，从数百万甲基化位点中，优选了10个差异化甲基化靶点（dmr），但是，该体系由于位点较多，导致成本和实用性较差，为此，我们从中优选了5个靶点，通过对额外122例样本(包含50例病人和72例健康人)的qpcr检测，最终筛选出2个靶标，并确定了合适的阈值。
3、需要指出的是，并非任一引物的设计都是能够实现高灵敏度及特异性检测，原因有两点：首先，同一基因的cpg位点可能多达数千个，不同的cpg位点的检测效能是有一定差异的；其次，不同基因的检测效能是有所差异的，通过增加检测基因的个数可以一定程度上提高灵敏度和特异性，但是基因数目增加会导致实用性大大降低，本专利技术基于基因组范围内百万级别的甲基化位点，选择最佳的cpg位点，以及最佳的基因组合，实现较高的灵敏度和特异性，满足临床需求的同时，兼顾较好的适用性。
4、鉴于此，本专利技术的方案为：
5、本专利技术的第一个方面，提供用于检测emx1、chfr基因甲基化的引物和探针组合物，包括引物对及探针组，引物对包括如seq id no：4-5、seq id no：7-8、seq id no：10-11所示的核苷酸序列；探针组包括如seq id no：6、seq id no：9、seq id no：12所示的核苷酸序列；
6、进一步地，所述探针组5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有荧光淬灭基团；
7、优选地，所述荧光基团分别不同地选自fam、vic、cy5、rox、hex、joe、ned、texasred或cy3；所述淬灭基团分别独立地选自mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3或tamra；
8、优选地，所述探针组中，如seq id no：6所示的探针序列5 '端标记fam荧光报告基团，3 '端标记bhq-1荧光淬灭基团；如seq id no：9所示的探针序列5 '端标记vic荧光报告基团，3 '端标记bhq-1荧光淬灭基团；如seq id no：12所示的探针序列5 '端标记有cy5荧光报告基团，3 '端标记bhq-3荧光淬灭基团；
9、本专利技术的第二个方面，emx1、chfr基因甲基化检测试剂盒，包括以上第一个方面所述的引物和探针组合物。本专利技术提供的试剂盒，采用taqman探针多重荧光pcr的方法，引物探针被设计在目的基因或目的基因启动子附近cpg位点，可特异性的和发生甲基化的序列结合，并发生pcr反应，而未发生甲基化的序列则不能与之结合。另外，同时检测转化后的内参基因actb，用以评估dna模板是否合格。
10、taqman探针法的工作原理为：
11、利用taq酶的5’→3’外切酶活性，由于探针的5’端标以荧光报告基团（如fam），靠近3’端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。因此，当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当pcr反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交，当pcr进入延伸（复制）期，taq酶从引物3’端开始，随新链沿dna模板延伸，当延伸到探针结合的位置时，在其5’→3’端外切酶活性作用下，将探针切断。此时，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。pcr反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。随着荧光信号的积累，便可通过荧光pcr仪检测出来。相对的，当探针序列与目的基因序列不匹配时，探针无法与目标序列结合，pcr延伸过程中就无法切断此特异性探针，也就不会出现相应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物和探针组合物，用于检测EMX1、CHFR基因甲基化，其特征在于，包括引物对及探针组，引物对包括如SEQ ID NO：4-5、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：10-11所示的核苷酸序列；探针组包括如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团分别不同地选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red或CY3；所述淬灭基团分别独立地选自MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3或TAMRA。
4.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组中，如SEQ IDNO：6所示的探针序列5 '端标记FAM荧光报告基团，3 '端标记BHQ1荧光淬灭基团；如SEQ IDNO：9所示的探针序列5 '端标记VIC荧光报告基团，3 '端标记BHQ1荧光淬灭基团；如SEQ ID
5.EMX1、CHFR基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的引物和探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、PCR反应混合液和纯化水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为EMX1、CHFR甲基化基因序列质粒，所述阴性对照为正常基因组转化后的DNA；和/或，所述PCR反应混合液包含DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、辅助增强剂及缓冲液。
8.权利要求5-7任意一项所述试剂盒在非诊断为目的检测EMX1、CHFR基因甲基化中的应用。
9.一种非诊断目的检测EMX1、CHFR基因甲基化的方法，其特征在于，步骤包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血液、血清或血浆。
...【技术特征摘要】
1.引物和探针组合物，用于检测emx1、chfr基因甲基化，其特征在于，包括引物对及探针组，引物对包括如seq id no：4-5、seq id no：7-8、seq id no：10-11所示的核苷酸序列；探针组包括如seq id no：6、seq id no：9、seq id no：12所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团分别不同地选自fam、vic、cy5、rox、hex、joe、ned、texas red或cy3；所述淬灭基团分别独立地选自mgb、bhq1、bhq2、bhq3或tamra。
4.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述探针组中，如seq idno：6所示的探针序列5 '端标记fam荧光报告基团，3 '端标记bhq1荧光淬灭基团；如seq idno：9所示的探针序列5 '端标记v...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵鹏飞，芮立，
申请(专利权)人：上海信诺佰世医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：
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