【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为一种高效靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna及优化方法。
技术介绍
1、鸡去甲基化酶基因fto，该基因在鸡的生长发育、代谢调控等方面发挥重要作用，sirna(小干扰rna)在基因功能鉴定中扮演着重要角色，特别是在针对特定基因，鸡去甲基化酶基因fto的敲降研究中，sirna是由20—25个核苷酸组成的双链rna分子，通过rna干扰(rnai)通路，与互补mrna分子杂交干扰基因表达，当sirna与靶mrna结合后，会触发mrna的降解，进而抑制特定基因的基因表达，利用设计好的sirna，可以特异性地针对鸡去甲基化酶基因fto进行敲降，通过特异性敲降鸡去甲基化酶基因fto，可以观察和研究该基因在细胞或生物体中的功能，可以为鸡fto功能的进一步研究提供基础资料；
2、现有的靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna存在：无法通过调控fto基因的表达来控制鸡的脂肪沉积和代谢，不利于培育出具有优良肉质、更高生长速度和更低脂肪含量的鸡种，且育种方法效率和精准度低，造成传统育种方法中可能出现的不可预测性的问题没有解决，为此提出一种靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna解决以上问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高效靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna及优化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna，包括步骤一，sirna制备；步骤二，纯化；步
3、其中上述步骤一中，利用先进的dna/rna合成仪分别合成长度为21个核苷酸的正义链和反义链，正义链序列：5'caagaggaacauuggaaua3'(seq no.1)反义链序列：5'uauuccaauguuccucuug3'(seq no.2)，确保合成的rna序列的准确性和纯度，通过hplc(高效液相色谱)方法进行纯化；
4、其中上述步骤二中，将含有醋酸钾、醋酸镁和hepes-koh的退火缓冲液与合成的正义链和反义链rna分子按一定浓度混合，混合液加热至90℃进行变性，然后逐渐降温至37℃进行温育，时间控制在1小时，使两条链退火形成双链sirna分子；
5、其中上述步骤三中，通过琼脂糖凝胶电泳方法验证双链sirna的形成和纯度；
6、其中上述步骤四中，将纯化的sirna分子保存在适当的缓冲液中，并储存于-20℃备用；
7、其中上述步骤五中，使用无菌水或rnaase-free的水将sirna稀释，浓度为100nmol/l，在无菌的离心管中，首先加入适当体积的无血清培养基，如opti-mem，然后加入所需量的sirna溶液；轻轻混合溶液，确保sirna均匀分散在培养基中；在另一个无菌的离心管中，加入相同体积的无血清培养基，然后加入适当量的lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混合溶液；将含有lipofectamine 2000的核酸转染试剂滴加到含有sirna的溶液中，轻轻混合，避免剧烈震荡；室温下孵育混合液5分钟，以便形成sirna-核酸转染试剂复合物；
8、其中上述步骤六中，提取鸡fto基因，包括以下步骤：
9、(1)材料准备：获取鸡的组织样本(如肝脏、下丘脑等)，确保样本新鲜且无污染；
10、(2)试剂准备：准备dna提取所需的试剂，如dna提取试剂盒、蛋白酶k、乙醇、缓冲液等；
11、(3)细胞裂解：将组织样本切碎，加入蛋白酶k和细胞裂解液，通过机械破碎或酶解作用使细胞裂解，释放dna；
12、(4)dna纯化：使用dna提取试剂盒，通过吸附、洗涤、洗脱等步骤去除杂质，纯化dna；
13、(5)设计引物：根据已知鸡fto基因的部分序列，如seq id no:1或seq id no:2中所示的部分，可以根据序列设计pcr引物，引物长度通常在18—25个碱基之间，gc含量在30％～60％之间，gc含量表示sirna序列中碱基g(鸟嘌呤)和c(胞嘧啶)的比例，tm值在40～65℃之间，tm表示退火温度；
14、通过引物设计软件primer3来辅助引物设计和tm值计算
15、tm＝δh/(δs+r×ln(c/4))+16.6log([k+]/(1+0.7[k+]))-273.15
16、式中，δh和δs是热动力学参数，r表示摩尔气体常数，c是寡核苷酸的浓度，[k+]是离子强度；
17、(6)pcr扩增：使用设计好的引物和提取的dna作为模板，进行pcr扩增；
18、(7)电泳验证：将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据pcr产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×tae浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化pcr产物，通过电泳方法检测pcr产物的质量和大小初步判断扩增结果，确保其与目标dna序列相符；
19、(8)测序验证：采用sanger测序方法对pcr产物进行测序，将测序结果与已知的fto基因序列进行比对，利用生物信息学工具(如blast)评估序列相似性；如果序列相似性高(通常需要达到95％以上)，则可以认为扩增产物为fto基因序列；
20、其中上述步骤七与扩增产物放入培养基中，培养基中可以含有适量的血清和抗生素，以帮助提高转染效率，将sirna-核酸转染试剂复合物转染到目标细胞中，通过内吞作用进入细胞：当sirna-核酸转染试剂复合物与细胞接触后，复合物会通过细胞的内吞作用进入细胞内部；
21、在内吞过程中，细胞表面的受体与转染复合物中的特定部分(如脂质体的正电荷部分)相互作用，促进复合物与细胞膜的融合；
22、随后，细胞膜内陷形成囊泡，将转染复合物包裹在内，并通过细胞内部的运输机制(如内体-溶酶体途径)最终释放到细胞质中；
23、进入细胞质的转染复合物在特定的酶，如dicer酶，作用下被进一步处理，形成risc，即rna诱导的沉默复合物；
24、risc与目标mrna特异性结合，并引导其降解或抑制其翻译，从而实现对目标基因的沉默效果；
25、sirna是一种短链rna分子，能够通过与靶mrna的特定序列结合，导致mrna的降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因的表达。
26、进一步，所述步骤六中，pcr扩增过程包括变性、退火和延伸三个主要步骤，三个步骤在一个pcr仪中循环进行，
27、第一步、98℃预变性1分钟；
28、第二步、进行30个循环，每个循环依次为：在变性步骤中，98℃处理10秒，通过高温使dna双链分离成单链；在退火步骤中：50℃处理30秒，引物结合到目标dna的单链上；在延伸步骤中，72℃处理30秒，dna聚合酶在引物的引导下合成新的dna链；
29、第三步、72℃处理5分钟进行延伸，在pcr反应结束后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA，包括步骤一，siRNA制备；步骤二，纯化；步骤三，体外退火；步骤四，验证与纯化；步骤五，储存；步骤六，提取鸡FTO基因，步骤七，转染细胞；其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA，其特征在于：上述步骤六中，提取鸡FTO基因，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA，其特征在于：上述步骤七与扩增产物放入培养基中，培养基中含有适量的血清和抗生素，以帮助提高转染效率，将siRNA-核酸转染试剂复合物转染到目标细胞中，通过内吞作用进入细胞：当siRNA-核酸转染试剂复合物与细胞接触后，复合物会通过细胞的内吞作用进入细胞内部；
4.根据权利要求2所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA，其特征在于：所述步骤六中，PCR扩增过程包括变性、退火和延伸三个主要步骤，三个步骤在一个PCR仪中循环进行，
5.根据权利要求3所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA，其特征在于：所述步骤七中，使用实时定量荧光PC
6.根据权利要求1所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因FTO的siRNA优化方法，其特征在于：引入深度学习算法进行序列优化，以确保合成的siRNA序列具有最高的靶向效率和最小的脱靶效应；具体过程为：
...【技术特征摘要】
1.一种靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna，包括步骤一，sirna制备；步骤二，纯化；步骤三，体外退火；步骤四，验证与纯化；步骤五，储存；步骤六，提取鸡fto基因，步骤七，转染细胞；其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna，其特征在于：上述步骤六中，提取鸡fto基因，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种靶向鸡去甲基化酶基因fto的sirna，其特征在于：上述步骤七与扩增产物放入培养基中，培养基中含有适量的血清和抗生素，以帮助提高转染效率，将sirna-核酸转染试剂复合物转染到目标细胞中，通过内吞作用进入细胞：当sirna-核酸转染试剂复合物与细胞接触后，复合物会通过细胞的内吞作用...
【专利技术属性】
技术研发人员：束婧婷，单艳菊，章明，姬改革，巨晓军，刘一帆，屠云洁，肖芹，盛中伟，邹剑敏，陈智武，赵伟东，郑国庆，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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