【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白纯化，尤指纯化重组带状疱疹蛋白的方法。
技术介绍
1、带状疱疹由潜伏在神经元内的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，vzv)重新激活，表现为成簇集型水泡，通常出现在老年人、儿童免疫力低下或患有慢性皮肤病的人群。vzv由双链dna、核衣壳及其表面包膜附着的糖蛋白组成，其中糖蛋白在侵染细胞并发挥免疫原性的过程中起到重要作用。vzv病理学的一个标志是在皮损中形成多核细胞，这种多核细胞是由糖蛋白gb、gh和gl介导的细胞间融合构成的。糖蛋白e(ge)是最丰富的一类蛋白，具有高度免疫原性，也是研究重组带状疱疹蛋白的重要对象。经基因重组技术改造后的ge蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(cho)中表达特异性抗原制成重组亚单位疫苗，刺激机体产生th1型免疫应答，对免疫力低下的人群有很好的保护效果。
2、近些年来，围绕重组带状疱疹蛋白上游工艺及免疫原性的探究层出不穷，但下游纯化工艺尚不成熟。在生物制品生产过程中，宿主细胞系中表达目标蛋白时会产生来自宿主细胞的结构蛋白和分泌蛋白(hcp)，刺激人体免疫系统产生不良反应。因此开发纯化工艺时需要检测hcp残留，特别对于重组带状疱疹蛋白，hcp残留往往需要从几十万ppm降低至几百ppm。
3、在目标蛋白上携带标签，采用亲和层析来纯化能够获得较纯的产物，但后续需要切除标签，操作难度大，并且在酶切的过程容易产生难以去除的副产物，往往适用于小批量纯化来探究重组带状疱疹的生物学功能。日益精进的层析介质给纯化方式带来更多的选择，经疏水、离子交换或分子筛等
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，具有流程短、操作简便且质量稳定的特点，纯化后的蛋白可达质量要求：纯度≥95％及宿主细胞蛋白残留<500ppm。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、技术方案1
4、一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，包括：
5、将重组带状疱疹蛋白的粗分离样品溶液依序经过diamond mix-a、butylbestarose 4ff、diamond mmc mustang和diamond mix-a mustang作为层析介质的纯化步骤。
6、上述方案中，diamond mix-a是通过两次交联分别将苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵两种基团偶联在高刚性琼脂糖微球上形成的一种多模式强阴离子交换介质，该种介质不仅具有离子交换功能，还具有疏水和氢键作用，可以有效地去除聚体、dna、宿主蛋白、内毒素、proteina等杂质。
7、上述方案中，butyl bestarose 4ff是在4％的琼脂糖基架上偶联丁基脂肪链而成的，琼脂糖基架的高物理和化学稳定性，使其具有良好的压力流速性能，成为规模纯化工艺的理想选择，特别是在需要高流速分离过程的捕获或中度纯化阶段，优化后的配基密度适合疏水性较强的生物分子的分离纯化。
8、上述方案中，diamond mmc mustang是将带有苯环和羧基的复合基团偶联在平均颗粒大小为40μm的高刚性琼脂糖微球上形成的一种多模式弱阳离子交换介质，该种介质结合了阳离子交换和疏水作用，适用于生物分子的捕获和纯化。
9、上述方案中，diamond mix-amustang是通过两次交联分别将苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵两种基团偶联在颗粒较小的高刚性琼脂糖微球上形成的一种多模式强阴离子交换介质，这种介质可以用于生物分子的纯化，特别是在抗体纯化中作为精纯步骤。
10、作为优选方案，所述重组带状疱疹蛋白粗分离样品过0.45μm滤膜后直接进行diamond mix-a多模式强阴离子层析。
11、作为优选方案，将diamond mix-a作为层析介质的纯化步骤1，工艺条件包括：所述重组带状疱疹蛋白的上样量为7～9mg/ml、接触时间为5～7min、上样蛋白浓度为≤1.5mg/ml；使用缓冲液组合1，所述缓冲液组合1包括平衡缓冲液1、清洗缓冲液1及洗脱缓冲液1，具体组成及参数控制为：
12、平衡缓冲液1：15～25mm pb，ph6.5～7.5；
13、清洗缓冲液1：15～25mm pb+0.40～0.60m精氨酸盐酸盐，ph5.5～6.5；
14、洗脱缓冲液1：15～25mm pb+0.60～0.80m精氨酸盐酸盐，ph5.5～6.5。
15、在更换洗脱缓冲液后约1cv，洗脱峰明显上升时开始收集洗脱液约3cv，得到diamond mix-a的洗脱液。
16、作为优选方案，所述diamond mix-a层析的洗脱液用饱和硫酸铵和1mtris分别调节电导和ph与butyl bestarose 4ff的平衡缓冲液保持一致后进行butyl bestarose 4ff疏水作用层析。
17、作为优选方案，将butyl bestarose 4ff作为层析介质的纯化步骤2，工艺条件包括：将调节电导和ph的diamond mix-a层析的洗脱液进行上样，上样量为6～8mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合2，所述缓冲液组合2包括平衡缓冲液2、清洗缓冲液2及洗脱缓冲液2，具体组成及参数控制为：
18、平衡缓冲液2：15～25mm pb+0.50～0.70m硫酸铵，ph6.0～7.0；
19、清洗缓冲液2：15～25mm pb+0.30～0.40m硫酸铵，ph6.0～7.0；
20、洗脱缓冲液2：15～25mm pb+0.05～0.15m硫酸铵，ph6.0～7.0。
21、在更换洗脱缓冲液后约1cv，洗脱峰明显上升时开始收集洗脱液约3cv，得到butylbestarose 4ff的洗脱液。
22、作为优选方案，所述butyl bestarose 4ff层析的洗脱液用纯水和0.5m柠檬酸分别调节电导和ph与diamond mmc mustang的平衡缓冲液保持一致后进行diamond mmcmustang多模式弱阳离子交换层析。
23、作为优选方案，将diamond mmc mustang作为层析介质的纯化步骤3，工艺条件包括：将调节电导和ph的butyl bestarose 4ff的洗脱液进行上样，上样量为3～4mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合3，所述缓冲液组合3包括平衡缓冲液3及洗脱缓冲液3，具体组成及参数控制为：
24、平衡缓冲液3：15～25mm pb+0～0.10m氯化钠，ph5.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
2.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
3.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
8.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，
9.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
11.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
12.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
2.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
3.一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，其特征在于，包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪，崔晴晴，赵作威，黄玉萍，倪春杰，
申请(专利权)人：博格隆浙江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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