【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌芽孢，具体涉及一种高纯度芽孢菌片及其制备方法和应用。
技术介绍
1、芽孢是由芽孢杆菌属或梭菌属等细菌在营养匮乏或其他不利环境下形成的休眠体。芽孢具有的多层结构作为防止外来物质入侵的第一道屏障，赋予了芽孢对温度、酸碱度、辐射等处理过程中极强的抵抗力，使芽孢能够在极端条件下存活。因此，芽孢菌片常用于环氧乙烷、过氧化氢、臭氧和等离子体等灭菌效果验证和评价以及无菌冷灌装生产线的性能验证。枯草芽孢杆菌atcc9372(bacillus subtilis atcc9372，b.subtilis atcc9372)已成为国际药典(《中国药典》、《欧洲药典》等)和标准(《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(gb 15981～1995)、《消毒技术规范》(2002版)等)中消毒剂检测以及灭菌质量控制方面的重要参考标准生物菌，常以浓度为(1～5)×106cfu/片的测试载体(布片/不锈钢片)用于常温或低温环境现场灭菌效果评价。
2、目前，传统方法制备芽孢测试载体存在一系列问题，诸如制备时间过长(超过5天)、纯度较低(通常在60％至80％之间)、测试载体生物活体负载量差异显著(相差2到3个数量级)等。这些问题严重影响了芽孢菌片对消毒器械灭菌效果评价的准确性。中国专利技术专利cn111349592a介绍了一种产孢培养基和细菌芽孢的制备方法。该专利通过液体培养基培养芽孢杆菌，利用triton x-100裂解未形成芽孢的营养体，最终获得纯度较高的芽孢。然而这种方法虽然在一定程度上缩短培养时间并提高了芽孢纯度，但由于芽孢是含水量低
3、此外，市售可用于测试灭菌效果的芽孢载体通常是细菌营养体和芽孢的混合物，每片高纯度芽孢载体的售价在60到100元之间不等，这显著增加了测试成本。因此，提供一种更为高效的、经济的高纯度芽孢菌片的制备方法具有重要的意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种高纯度芽孢菌片及其制备方法和应用。本专利技术提供的芽孢菌片制备方法的成本价格仅为2～3元/片，制备时间短(1～2天)，大幅降低了测试成本和费用。此外，本专利技术制备的芽孢菌片具有纯度高(≥99％)、负载量准确及室温储存一个月不变性等优点，可对消毒器械灭菌效果进行准确评价，并且回收率高，可进一步提高芽孢菌片的评价实用性。
2、为实现上述目的，本专利技术采取以下的技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种高纯度芽孢菌片的制备方法，包括如下步骤：
4、步骤1、制备产芽孢琼脂培养基；
5、步骤2、高纯度芽孢的快速制备和纯化：
6、步骤2.1、将活化后的b.subtilis atcc9372划线于lb琼脂培养基中，37℃恒温过夜培养至产生单菌落；挑取单菌落接种于lb液体培养基，培养至对数期获得种子菌液，种子菌液的菌体浓度为1x106～5x108cfu/ml；
7、步骤2.2、将种子菌液接种于产芽孢琼脂平板培养基，涂布均匀；将接种后的产芽孢琼脂平板培养基置于恒温培养箱中进行两阶段变温培养，第一阶段37℃培养10～18h，第二阶段50～70℃培养12～24h；两阶段变温培养后，向产芽孢的琼脂平板培养基中加入pbs缓冲液反复冲洗菌落，然后将洗净后的菌落收集后离心，得到未纯化的芽孢沉淀；
8、步骤2.3、将未纯化的芽孢沉淀用无菌水制备成芽孢悬液进行低温离心处理，得到湿润芽孢沉淀；依次用不同浓度的乙醇对所述湿润芽孢沉淀进行离心脱水，倒出上清后，待离心管内乙醇自然挥发后，即获得无水高纯度芽孢；
9、步骤3、制备高纯度芽孢菌片：采用无菌水充分溶解无水高纯度芽孢，配制吸光度(od600nm)为0.15～1.55的芽孢悬液，吸取芽孢悬液均匀涂布于菌片载体上，随后进行真空冷冻干燥即得。
10、进一步的，步骤1中产芽孢琼脂培养基采用如下方法制备：每1000ml蒸馏水中加入牛肉膏粉1.0～5.0g，蛋白胨8.0～10.0g，氯化钠5.0～6.0g，七水硫酸镁0.1～0.3g，硫酸锰0.02～0.05g，硫酸亚铁0.0001～0.0003g，琼脂15～20g，室温调节ph值7.0～7.5；然后将其在121℃灭菌15～20min，降温至40～50℃进行倒平板操作，冷却固化，得到产芽孢琼脂平板培养基。
11、优选的，步骤1中每1000ml蒸馏水加入牛肉膏粉2.5g，蛋白胨8.0g，氯化钠5.0g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.0001g，琼脂15g。
12、进一步的，步骤2.2中第一阶段37℃培养10h，第二阶段65℃培养18h。
13、进一步的，步骤2.2中种子菌液为0.1ml。
14、进一步的，步骤2.2中，每次加入pbs缓冲液为10ml。
15、进一步的，步骤2.2中，离心的转速为15000rpm。
16、进一步的，步骤2.2还包括取部分未纯化的芽孢沉淀用无菌水溶解，然后在载玻片上挑选部分芽孢悬液，进行芽孢染色后光学显微镜进行观察，产芽孢率≥90％。
17、进一步的，步骤2.3中低温离心处理为三阶段低温离心处理；具体方式为向装有芽孢悬液的离心管中加入5ml的无菌水，轻轻冲洗上层分层的细菌营养体，离心后倒出上层悬液；其中，第一阶段离心速度为12000～15000rpm，时间为5min；第二阶段离心速度为9000～10000rpm，时间为5min；第三阶段离心速度为6000～8000rpm，时间为10min。
18、优选的，步骤2.3中第一阶段离心速度为12000rpm，时间为5min；第二阶段离心速度为10000rpm，时间为5min；第三阶段离心速度为8000rpm，时间为10min。
19、进一步的，步骤2.3中不同浓度的乙醇的浓度梯度分别为质量浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇；离心脱水的参数为离心速度6000rpm，时间为5min。
20、进一步的，步骤2.3还包括挑取一环无水高纯度芽孢沉淀，用无菌水稀释后固定于载玻片进行芽孢染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤1中产芽孢琼脂培养基采用如下方法制备：每1000mL蒸馏水中加入牛肉膏粉1.0～5.0g，蛋白胨8.0～10.0g，氯化钠5.0～6.0g，七水硫酸镁0.1～0.3g，硫酸锰0.02～0.05g，硫酸亚铁0.0001～0.0003g，琼脂15～20g，室温调节pH值7.0～7.5；然后将其在121℃灭菌15～20min，降温至40～50℃进行倒平板操作，冷却固化，得到产芽孢琼脂平板培养基。
3.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2中第一阶段37℃培养10h，第二阶段65℃培养18h。
4.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2中，离心的转速为15000rpm。
5.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2还包括取部分未纯化的芽孢沉淀用无菌水溶解，然后在载玻片上挑选部分芽孢悬液，进行芽孢染色后光学显微镜进行观察，产芽孢率
6.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.3中低温离心处理为三阶段低温离心处理；具体方式为向装有芽孢悬液的离心管中加入5mL的无菌水，轻轻冲洗上层分层的细菌营养体，离心后倒出上层悬液；其中，第一阶段离心速度为12000～15000rpm，时间为5min；第二阶段离心速度为9000～10000rpm，时间为5min；第三阶段离心速度为6000～8000rpm，时间为10min。
7.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.3中不同浓度的乙醇的浓度梯度分别为质量浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇；离心脱水的参数为离心速度6000rpm，时间为5min。
8.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，包步骤2.3还包括挑取一环无水高纯度芽孢沉淀，用无菌水稀释后固定于载玻片进行芽孢染色，随后采用光学显微镜进行观察，芽孢纯度≥99％。
9.一种高纯度芽孢菌片，其特征在于，采用权利要求1～8任意一项所述高纯度芽孢菌片的制备方法制备所得。
10.权利要求1～8任意一项所述高纯度芽孢菌片的制备方法或权利要求9所述高纯度芽孢菌片在检测消毒器械灭菌效果中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤1中产芽孢琼脂培养基采用如下方法制备：每1000ml蒸馏水中加入牛肉膏粉1.0～5.0g，蛋白胨8.0～10.0g，氯化钠5.0～6.0g，七水硫酸镁0.1～0.3g，硫酸锰0.02～0.05g，硫酸亚铁0.0001～0.0003g，琼脂15～20g，室温调节ph值7.0～7.5；然后将其在121℃灭菌15～20min，降温至40～50℃进行倒平板操作，冷却固化，得到产芽孢琼脂平板培养基。
3.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2中第一阶段37℃培养10h，第二阶段65℃培养18h。
4.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2中，离心的转速为15000rpm。
5.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方法，其特征在于，步骤2.2还包括取部分未纯化的芽孢沉淀用无菌水溶解，然后在载玻片上挑选部分芽孢悬液，进行芽孢染色后光学显微镜进行观察，产芽孢率≥90％。
6.根据权利要求1所述的高纯度芽孢菌片的制备方...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈缘，潘文锋，钟奶才，覃有钊，钟近艺，廖景文，杨明瑾，
申请(专利权)人：广州先进技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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