一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法及其应用技术

技术编号：43137861 阅读：21 留言：0更新日期：2024-10-29 17:42

本发明专利技术公开了一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法及其应用。利用该方法获得的M6D4/+双转基因杂合子小鼠具有骨骼肌特异表达Cre重组酶时DUX4基因表达量增加，他莫昔芬注射后骨骼肌中特异性表达Cre重组酶的优势，该双转基因杂合子小鼠3周龄时使用他莫昔芬诱导，9周龄时可用于在生理学、病理学和分子学方面对模型进行评估。利用本发明专利技术所述方法构建的双转基因小鼠在骨骼肌方面出现了类FSHD样改变，丰富了FSHD机制研究和治疗策略研究的动物模型选择，同时也为FSHD的早期干预治疗提供了宝贵的动物模型。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物模型，尤其涉及一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

1、面肩肱骨肌营养不良症(facioscapulohumeral muscular dystrophy,fshd)是最常见的遗传性肌肉疾病之一，通常表现为缓慢的进展，主要影响面部、肩膀和上臂的肌肉，通常呈不对称的模式。此外，许多患者出现躯干和腿部肌肉无力。大多数患者在青春期后开始表现出明显的症状，而严重的病例可以在10岁之前表现出来。

2、目前普遍认为骨骼肌中dux4的异常表达是fshd的发病机制。fshd根据不同的致病机制可分为两种类型：fshd1和fshd2。fshd1是一种更常见的形式，主要是由染色体4q35的亚端粒区d4z4重复序列的收缩引起的。健康个体通常有11-100个重复单位，而fshd1患者表现出数量减少(1-10个重复单位)，并携带特定的4qa等位基因。fshd2与涉及smchd1的缺失有关，smchd1是一种位于18号染色体上的dna甲基化调节因子，通常通过高甲基化来维持d4z4的沉默。这两种类型都是通过表观遗传变化导致骨骼肌中dux4表达的去抑制而导致发病。

3、自从确定了dux4在fshd中的关键作用以来，开发与dux4相关的细胞和动物模型已经成为研究dux4介导的fshd中的骨骼肌毒性和评估潜在的dux4靶向治疗的焦点。然而，构建fshd的动物模型具有挑战性，其中一个主要障碍是dux4在动物模型中表达渗漏的问题。takako jones等证实了flexdux4转基因在未产生基因重组的情

4、由于伦理学限制，很多研究无法在人体中进行，为了更深入地研究fshd，需要借助一定的动物模型来模拟人体的情况。因此，丰富fshd动物模型的种类对fshd的机制研究和治疗策略研究具有重要的意义，同时，针对严重的病例，早期干预治疗的动物模型也十分重要。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法；本专利技术还有一个目的在于提供所述构建方法获得的双转基因杂合子小鼠在fshd早期干预和治疗评价中的应用。

2、本专利技术提供的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括将myf6-creert2小鼠与flexdux4小鼠配繁后获得雄性个体。

3、其中，作为一种优选的实施方式，所述myf6-creer2小鼠为杂合子小鼠，由myf6-creer2转基因小鼠与c57bl/6小鼠配繁后获得；所述flexdux4小鼠为杂合子小鼠，由flexdux4转基因小鼠与c57bl/6小鼠配繁后获得。作为其他可选的实施方式，亦可选用myf6-creert2或flexdux4的纯合子小鼠与另一种杂合子小鼠配繁，亦可选用myf6-creert2和flexdux4的纯合子小鼠配繁获得。不同于acta1-mcm转基因小鼠是在人acta1启动子的控制下表达mercremer双融合蛋白，myf6-creert2小鼠是将creert2-pa插入到小鼠myf6基因起始密码子处。除特殊说明外，本专利技术所述的myf6为肌原因子6(myogenic factor 6)表达基因；所述肌原因子6是一种参与肌肉发育的dna结合蛋白。

4、进一步地，所述myf6-creert2小鼠通过myf6-creert2基因型鉴定相对于野生型c57bl/6小鼠在371bp具有杂合子特征条带。具体来说，利用引物p1、p2和p4进行pcr反应，野生型野生型c57bl/6小鼠只能被鉴定出单一的867bp条带，而m6d4/+双转基因小鼠还能被鉴定出在371bp具有杂合子特征条带。

5、进一步地，所述flexdux4小鼠通过flexdux4基因型鉴定相对于野生型c57bl/6小鼠在415bp具有杂合子特征条带。具体来说，利用引物21306、26766和oimr9021进行pcr反应，野生型c57bl/6小鼠只能被鉴定出单一的198bp条带，而m6d4/+双转基因小鼠还能被鉴定出在415bp具有杂合子特征条带。

6、进一步地，本专利技术提供的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法可使用他莫昔芬(tamoxifen,tmx)对不超过6周龄的m6d4/+双转基因小鼠进行诱导，诱导后的小鼠骨骼肌表现出类似fshd的病例表现，如肌肉占体重比下降、四肢抓力下降、耐力下降、中央核肌纤维数量增多、骨骼肌纤维化程度增高、骨骼肌中dux4及其靶基因(wfdc3、agtr2、serpinb6c)表达增高。更优选地，本专利技术提供的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法优选不超过4周龄的m6d4/+双转基因小鼠进行诱导。

7、进一步地，本专利技术用于诱导的所述他莫昔芬为100～200mg/ml的乙醇溶液，然后加入到温无菌玉米油中，37℃摇匀备用，最终用于诱导的他莫昔芬浓度为5～10mg/kg。优选地，所述最终用于诱导的他莫昔芬浓度为10mg/kg。

8、作为本专利技术的优选方案，所述诱导是对3周龄的雄性m6d4/+双转基因小鼠每周腹腔注射一次5～10mg/kg的他莫昔芬无菌玉米油。

9、利用本专利技术提供的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法获得的m6d4/+双转基因杂合子小鼠，具有骨骼肌特异表达cre(cyclization recombination enzyme)重组酶时，原本以反义方向插入到26rosa启动子下的人类dux4基因的3个外显子和2个内含子通过cre进行单向重组，将dux4基因向正义方向转变，然本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述方法包括将Myf6-CreERT2小鼠与FLExDUX4小鼠配繁后获得雄性个体。

2.根据权利要求1所述的一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述M6D4/+双转基因小鼠通过Myf6-CreERT2基因型鉴定相对于野生型C57BL/6小鼠在371bp具有杂合子特征条带。

3.根据权利要求1所述的一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述M6D4/+双转基因小鼠通过FLExDUX4基因型鉴定相对于野生型C57BL/6小鼠在415bp具有杂合子特征条带。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：使用他莫昔芬对不超过6周龄的M6D4/+双转基因小鼠进行诱导。

5.根据权利要求4任意一项所述的一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述他莫昔芬的诱导浓度为5～10mg/kg。

6.权利要求1所述一种M6D4/+双转基因小鼠模型的构建方法获得的双转基因杂合子小鼠在

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【技术特征摘要】

1.一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述方法包括将myf6-creert2小鼠与flexdux4小鼠配繁后获得雄性个体。

2.根据权利要求1所述的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述m6d4/+双转基因小鼠通过myf6-creert2基因型鉴定相对于野生型c57bl/6小鼠在371bp具有杂合子特征条带。

3.根据权利要求1所述的一种m6d4/+双转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述m6d4/+双转基因小鼠通过flexdux4基因型鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡平，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：

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