【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是在眼部疾病中的应用。
技术介绍
1、由细胞释放到细胞外或血浆中而进入血液循环、被称为“细胞外囊泡”（extracellular vesicles， evs）的细胞分泌物已经得到了广泛的关注和研究。“细胞外囊泡”主要分为外泌体（exosome）、微泡（microvesicle）或微颗粒（microparticle）和凋亡小体（apoptotic body）三类，其中主要成分是外泌体。目前，外泌体被广泛用于多种损伤修复及免疫性疾病的治疗。然而，外泌体其细胞靶向性仍需进一步提高，以减少副作用和提升疗效。其次，细胞分泌外泌体的效率有限，收集一定量的外泌体需要投入大量时间。因此，进一步提升其靶向性、生物安全性和产量是未来需要解决的问题。
2、细胞纳米囊泡的修饰策略包括基因工程和化学修饰。利用基因工程将目的蛋白或多肽的基因序列与选定的外泌体表面蛋白的基因序列融合，可使目的蛋白或引导肽表达于外泌体表面。溶酶体相关膜蛋白2b（lysosome associated membrane protein 2b,lamp2b）是lamp家族成员，是一种可用于携带靶向蛋白或多肽的膜蛋白。
3、另外，在细胞内还存在大量纳米囊泡，游离在各种富有膜的细胞器之间，介导细胞内物质运输及细胞的分泌途径。其中构成型分泌囊泡是细胞内囊泡（intracellularvesicle，ivs）的主要类型，由内质网产生，与高尔基体、溶酶体和细胞膜等进行物质交换，介导了细胞内
4、自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）是一类常见致盲性眼病，主要累及葡萄膜和视网膜，可引起白内障、青光眼、黄斑病变和视神经萎缩等多种眼部并发症，导致视力严重下降。cd4阳性辅助性t细胞（t helper cells, th cells），特别是分泌ifn-γ的th1和分泌il-17a的th17细胞，是自身免疫葡萄膜炎的主要效应t细胞，它们的异常激活在疾病发生中发挥重要致病作用。cd40l属于tnf超家族，被认为是cd4 + t淋巴细胞的早期激活标记。cd40/cd40l参与触发下游多种免疫信号通路，早期研究已证明cd40/cd40l共刺激信号传导是产生t细胞依赖性抗体应答和记忆b细胞分化所必需。巨噬细胞和dc细胞中cd40/cd40l信号激活后，诱导细胞因子分泌和表面活化分子表达，参与调节cd4 + t细胞和cd8 +t细胞交叉刺激和激活。在各种自身免疫性疾病中也存在cd40/cd40l信号通路表达调控失调，其可能促进致病性自身免疫反应的启动或维持。因此，靶向cd40/cd40l通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。
5、病理性视网膜新生血管（retinal neovascularization，rnv）是几种常见致盲性视网膜疾病的关键病理变化，包括糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, dr)、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,rop) 等。目前的临床治疗包括玻璃体内注射anti-vegf药物、视网膜光凝和玻璃体切割，尽管玻璃体内注射anti-vegf药物可以抑制视网膜和脉络膜nv的进一步形成，但其治疗效果一直存在争议，大约30%的患者对anti-vegf药物治疗的反应不佳，并且激光和手术治疗效果有限，仍有相当数量的患者丧失视功能。因此，需要寻找更有效、更安全的替代方法。
6、既往研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cell, msc）具有促进创伤修复、神经保护等作用，广泛用于视网膜和神经系统疾病的治疗研究。但由于其具有细胞增殖的劣势限制了其临床转化及应用。msc衍生的囊泡具有干细胞的生物学特性，无核无遗传物质，具有极大的转化应用前景。对囊泡进行改造，使其具备靶向性可以提高囊泡的生物利用率。因此，对细胞内纳米囊泡进行针对性改造，使其具备靶向性，进行自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病研究，并寻找治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病药物具有重要意义。
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是作为具有靶向功能的药物载体的应用。
2、在本专利技术第一方面，提供一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡，其过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白。
3、具体地，所述的靶向分子包括但不仅限于多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合，特别是，所述的靶向分子为多肽。
4、在本专利技术的一些实施例中，所述的靶向分子为a25多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向t细胞。
5、在本专利技术的一些实施例中，所述的靶向分子为rgd多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向新生血管（例如视网膜新生血管）。
6、具体地，所述的靶向分子位于lamp2b的n端。
7、具体地，所述的融合蛋白结构包括：
8、1）lamp2b的n端-靶向分子-lamp2b的c端；
9、2）靶向分子-lamp2b的n端。
10、具体地，所述囊泡呈圆球形或者杯垫状。
11、具体地，所述囊泡的平均粒径为50-100nm（例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100nm），特别是65-85nm。
12、具体地，所述的细胞来源于哺乳动物，特别是人类。
13、具体地，所述细胞为真核细胞，特别是干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞（293t）、巨噬细胞、t细胞和肿瘤细胞中的至少一种；更具体地，所述干细胞为间充质干细胞（msc），包括但不限于：脐带间充质干细胞（uc-msc）、骨髓间充质干细胞（bm-msc）、脂肪间充质干细胞（ad-msc）、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
14、在本专利技术的一些实施例中，所述细胞为间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞（uc-msc）。
15、在本专利技术的一些实施例中，所述细胞为上皮细胞，例如293t细胞。
16、在本专利技术的一些实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，例如hela细胞。
17、具体地，所述囊泡由本专利技术第二方面所述方法制备得到。
18、在本专利技术第二方面，提供一种上述囊泡的制备方法。
19、具体地，所述的方法包括将过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白的细胞依次进行超声处理、离心处理、超速离心处理的步骤。
20、具体地，所述方法包括以下步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自：多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子为多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自A25多肽或RGD多肽。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子位于Lamp2b的N端。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%，和/或，所述超声处理的时间为10-20s。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。
9.根据权
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞和肿瘤细胞中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞包括：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
12.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡。
13.根据权利要求12所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡为A25-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡或RGD-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡。
14.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述疾病为眼部疾病。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述疾病为自身免疫性葡萄膜炎或视网膜新生血管疾病。
17.一种载药囊泡的制备方法，其包括以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体进行载药。
18.一种载药囊泡，其以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体。
...【技术特征摘要】
1.一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自：多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子为多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自a25多肽或rgd多肽。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子位于lamp2b的n端。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%，和/或，所述超声处理的时间为10-20s。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述离心处理的次数为两次，
10...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓敏，李柏宜，樊蕊嫣，张慧，李筱荣，
申请(专利权)人：天津医科大学眼科医院，
类型：发明
国别省市：
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