【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种用于鉴定小火蚁的胶体金试剂盒和鉴定方法。
技术介绍
1、小火蚁是世界自然保护联盟(iucn)收录的五种危害性最严重的入侵蚂蚁之一，多出现在海岸、易受干扰地带、人工林区、河岸地带和灌木丛林区。小火蚁具有较强的环境适应能力，其活动会破坏生物多样性，导致为害地昆虫及节肢类动物种群数量下降，甚至直接取代当地蚂蚁种群，造成作物减产、生态破坏，以及巨大的经济损失，另外小火蚁体型细小，肉眼难以发现，叮咬人和其他动物会产生强烈的疼痛感，并伴有不同程度的过敏现象。据报道，很多工人在从事农事操作过程中被小火蚁哲咬，工人被蛰刺眼睛后容易引起角膜损失，另外在非洲加蓬小火蚁经常在动物进食过程中攀咬其鼻子和眼睛造成家猫和野猪、大象等野生动物失明。
2、有研究显示，我国华南地区的林地是小火蚁入侵风险最大的地区，另外沿海地区、西南地区和中部地区也非常适合小火蚁的生长。现阶段最主要的鉴定方法，主要是通过形态学鉴定和dna条码技术进行鉴定。但小火蚁体型小，与一些近似昆虫外形相近且经常混合发生危害，在田间野外难以辨别，另外进行形态鉴定需要大量的知识储备，在野外田间难以实现。
3、目前常用的分子鉴定方法主要有rapd(randomly amplified polymorphic dna)、rflp(restriction fragment length polymorphism)、aflp(amplified fragmentlengthpolymorphism)、sscp(single st
4、综上，现有检测方法存在操作时间长、操作要求高、检测精准性差等缺点，有些检测方法价格昂贵。因此，势必要研究一种速度快、特异性高且成本低的小火蚁鉴定方法。
技术实现思路
1、本专利技术的首要专利技术目的在于提出一种用于鉴定小火蚁的胶体金试剂盒和鉴定方法，本专利技术解决了现有昆虫检测方法专业知识需求高、操作繁琐、时间长、限制性条件多等问题。
2、本专利技术提出一种用于鉴定小火蚁的胶体金试剂盒，该试剂盒中含有恒温扩增试剂和胶体金试纸条，恒温扩增试剂中含有用于鉴定鉴定小火蚁的引物对和探针，引物对包括核苷酸序列如seq id no:2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的下游引物；探针的核苷酸序列如seq id no:4所示。
3、本专利技术提出一种小火蚁的鉴定方法，采用上述胶体金试剂盒进行鉴定。
4、可选的，包括以下步骤：在恒温扩增试剂中加入待测昆虫的dna样本，恒温扩增反应后进行胶体金试纸条显色，判读结果。
5、本专利技术实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
6、本专利技术首先筛选得到一段特异性的基因组dna片段，该片段区别于传统的线粒体标记，为目标物种小火蚁独有，具有更高的特异性，降低了检测的假阳性率，提高了检出率和准确率，实现了在不同虫态、存活状态、标本不完整等情况下的准确检测。基于上述特异性基因组dna片段设计引物和探针，同时利用多酶恒温快速扩增结合胶体金技术，采用酶介导双重指数扩增技术(emdea)，15min左右即可完成全部反应，可在短时间内获得观察结果，适合多种样品的快速检测，实现即时检测。
7、本专利技术采用恒温快速扩增检测扩增稳定高效，最低检出限约为4ng，实现了对低浓度靶标基因的高灵敏度检测。
8、本专利技术的试剂盒和方法仅需使用金属浴即可完成全部反应过程，相较于其他方法依赖于pcr仪、荧光监测系统等，该方法可极大程度降低对试验设备的依赖，场景适用性更广，成本更低，胶体金试纸条安全环保，保存时间长先将待测样本进行恒温扩增后、采用胶体金试纸条进行检测。具有操作简单、反应速度快、对设备要求低等优点。
9、本专利技术的试剂和方法可以区分小火蚁及其相近物种，提高小火蚁的检出率和准确率，实现现场快速准确检测。非专业人员可轻松使用本专利技术的试剂和方法，为基层一线人员提供了一种能快速鉴定多小火蚁及其近似物种的新方法，为有效应对小火蚁这种入侵物种提供重要的技术支撑，将小火蚁对我国的社会与生态安全的威胁降到最低，对我国小火蚁的早期预警和防控具有重要意义。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于鉴定小火蚁的胶体金试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有恒温扩增试剂和胶体金试纸条，所述恒温扩增试剂中含有用于鉴定鉴定小火蚁的引物对和探针，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述下游引物和所述探针的5’端连接有不同的修饰基团A、修饰基团B，可选的，所述修饰集团A、修饰基团B独立的选自生物素、地高辛或FITC。
3.根据权利要求2所述的胶体金试剂盒，其特征在于，
4.根据权利要求1～3任一项所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增试剂包括引物混合物和反应酶系混合物；所述引物混合物中含有所述用于鉴定鉴定小火蚁的引物对和探针；
5.根据权利要求4所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述引物混合物中还含有Abuffer和B Buffer和ddH2O；可选的，所述Abuffer的体积百分比为60％～66.7％，所述Bbuffer的体积百分比为4％～6％。
6.根据权利要求4所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述反应酶系混合物中含有重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、核酸内切酶和逆转录酶；
7.根据权利要求4所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述反应酶系混合物中还含有dNTPs、冻干保护剂、缓冲盐、pH调节剂、酶的辅助因子和供能系统；
8.一种小火蚁的鉴定方法，其特征在于，采用如权利要求1～7任一项所述的胶体金试剂盒进行鉴定。
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的温度为32℃～38℃；
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定小火蚁的胶体金试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有恒温扩增试剂和胶体金试纸条，所述恒温扩增试剂中含有用于鉴定鉴定小火蚁的引物对和探针，所述引物对包括核苷酸序列如seq id no:2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:3所示的下游引物；所述探针的核苷酸序列如seq id no:4所示。
2.根据权利要求1所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述下游引物和所述探针的5’端连接有不同的修饰基团a、修饰基团b，可选的，所述修饰集团a、修饰基团b独立的选自生物素、地高辛或fitc。
3.根据权利要求2所述的胶体金试剂盒，其特征在于，
4.根据权利要求1～3任一项所述的胶体金试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增试剂包括引物混合物和反应酶系混合物；所述引物混合物中含有所述用于鉴定鉴定小火蚁的引物对和探针；
5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘聪辉，韩蕊，钱万强，马骏，唐宇哲，乔曦，万方浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：
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