【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及核酸的，具体涉及与基因活化相关联的寡核苷酸调节剂及其药物应用。
技术介绍
1、杜氏肌营养不良症(dmd)是一种隐性、x连锁遗传疾病，其发生频率为约3500至5000名男性新生儿之一。全球每年约有20000名儿童被诊断患有dmd。dmd导致患者在生命的第2-4个十年过早死亡。这种疾病是由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的dmd基因突变引起的，该蛋白质在肌肉纤维中很重要，它的缺失会导致肌肉无力，其随着时间的推移会变得更糟，因为肌肉细胞会崩解并逐渐丢失。约1/3的儿童由于抗肌萎缩蛋白基因的自发突变而罹患dmd，并且没有该疾病家族史。
2、抗肌萎缩蛋白是抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(dgc)的部分，它桥接了内部细胞骨架(f-肌动蛋白)和细胞外基质。以这种方式，它在收缩期间使肌肉纤维具有稳定性。贝克尔肌营养不良症(bmd)是一种较温和，进展性较低的疾病形式，也是由同一dmd基因的变化引起的。
3、一般而言，dmd患者携带的突变会产生不完全的抗肌萎缩蛋白(无义或移码突变)，这是无功能的，而在bmd中，表达分子量较低的内部缺失蛋白(衍生自框内缺失)，其具有部分功能性。
4、dmd基因高度复杂，包含至少七个独立的组织特异性启动子和两个聚腺苷酸化位点。此外，抗肌萎缩蛋白转录本是交替剪接的，产生一系列不同的转录本，编码大量蛋白质同种型。抗肌萎缩蛋白也在脑中表达，其在脑中的功能尚不为人知。然而，脑部抗肌萎缩蛋白的缺乏可能是许多dmd患者经历的认知问题的因素。
5、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(u
6、在早期人类肌肉发育中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白出现于肌膜处，并逐渐被抗肌萎缩蛋白取代至出生。在成人组织中，抗肌萎缩蛋白相关蛋白在肺、肾、肝、脾等多种组织中表达，不仅局限于肌肉中的神经肌肉和肌腱接合处，还出现于再生肌纤维和血管的肌膜中。据报道，两种抗肌萎缩蛋白相关蛋白启动子a和b受差异性调节以驱动两种不同的mrna同种型翻译成具有独特n末端和不同表达模式的全长抗肌萎缩蛋白相关蛋白。
7、与抗肌萎缩蛋白组织特异性启动子不同，驱动编码全长蛋白的基因的抗肌萎缩蛋白相关蛋白a启动子与基因5'端的cpg岛相关联。在许多组织中表达的抗肌萎缩蛋白相关蛋白a是在神经肌肉和肌腱连接处、脉络丛、软脑膜和肾小球的肌肉中表达的同种型，并且出现于再生肌纤维的肌膜中。与抗肌萎缩蛋白相关蛋白a的区别在于n末端作用结合位点略有不同的抗肌萎缩蛋白相关蛋白b，仅限于内皮细胞和血管。抗肌萎缩蛋白和抗肌萎缩蛋白相关蛋白都有由类似的内部启动子(dp71，dp140，up71，up140)驱动的较小的转录本。
8、抗肌萎缩蛋白相关蛋白是抗肌萎缩蛋白的常染色体和功能类似物，且能够补偿抗肌萎缩蛋白在dmd和bmd中的原发性缺陷。小鼠研究表明，抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因可作为抗肌萎缩蛋白基因的功能替代物，因此可作为抗肌萎缩蛋白缺乏引起的肌肉萎缩症的潜在治疗靶标。因此，基于抗肌萎缩蛋白相关蛋白的策略有可能为所有dmd/bmd患者(无论其遗传缺陷如何)提供治疗。
9、利用寡核苷酸诱导抗肌萎缩蛋白相关蛋白的转录和转录后水平表达，对于开发dmd和bmd(无论dmd基因中突变的位置)的新疗法而言，都是一种有吸引力的方法。然而，这种方法受到基因上调工具的限制[us20120122953a1和wo2019183005a1]。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本公开提供了一种寡核苷酸调节剂，例如小活化rna(sarna)分子，用于通过靶向utrn基因启动子并随后活化utrn基因转录并提高抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达水平以通过rna活化(rnaa)机制补偿抗肌萎缩蛋白缺陷，来治疗由缺乏抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白水平不足引起的疾病或病症(如dmd和bmd)。
2、具体地，专利技术人发现，这种能够活化/上调utrn mrna表达的sarna不随机分布在启动子上，而是簇集在某些特定的热点区域。只有utrn基因的启动子上的一些区域有利于sarna的基因活化，例如utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496、-351至-294、-236至-187和-101至-65。专利技术人还发现，utrn启动子区域内sarna的最佳靶序列/正义链包括具有以下标准的序列：(1)gc含量在35％至70％之间；(2)少于5个连续相同核苷酸；(3)3个或更少二核苷酸重复；和(4)3个或更少三核苷酸重复。作为该标准的有益结果，靶序列(例如，包含靶序列的分离的核酸序列)在与sarna相互作用时，与utrn mrna的基线水平相比，能使utrn mrna的表达活化/上调至少10％。至少部分基于这些发现，本公开内容的特征是sarna、组合物和药物组合物，其用于使utrn mrna的表达活化/上调至少10％(与utrn基因的基线水平相比)。本文还提供了用于预防或治疗个体中由抗肌萎缩蛋白表达不足、抗肌萎缩蛋白基因突变和/或低功能性抗肌萎缩蛋白水平引起的疾病或病症的方法，包括给予本文所述的sarna、组合物和/或药物组合物之任一者。
3、在本公开内容的一个方面，提供了一种能够活化/上调细胞中utrn基因表达的寡核苷酸调节剂(例如sarna分子)，该寡核苷酸调节剂(例如sarna)包含长度为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述连续寡核苷酸序列与seq id no:1200的等长区域具有至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％的序列同源性或互补性，由此与utrn基因的基线表达相比使基因的表达活化或上调至少10％。在一些实施方式中，seq id no:1200的等长区域位于utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496(seq id no:1207)、区域-351至-294(seq id no:1208)、区域-236至-187(seq id no:1209)或区域-101至-65(seq idno:1210)。
4、在某些实施方式中，本公开内容公开的sarna包括正义链和反义链，其中正义链和反义链各自包含互补区域，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链具有至少90％的互补性。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链位于两条不同的核酸链上。而在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链位于连续的核酸链(任选地为发夹式单链核酸分子)上，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。在某些实施方式中，本公开内容公开的正义链和反义链包括长度为0至6个核苷酸，或者长度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小活化RNA(saRNA)，其包含长度范围为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1200的等长部分具有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％同源性或互补性的连续核苷酸序列，其中所述saRNA使UTRN基因的表达相比UTRN基因的基线表达上调至少10％。
2.如权利要求1所述的saRNA，其中，SEQ ID NO:1200的等长部分位于UTRN基因转录起始位点上游的区域-636至-496(SEQ ID NO:1207)、区域-351至-294(SEQID NO:1208)、区域-236至-187(SEQ ID NO:1209)或区域-101至-65(SEQ ID NO:1210)。
3.如权利要求1-2中任一项所述的saRNA，其中，所述saRNA(1)具有35％至70％的GC含量；(2)具有少于5个连续相同核苷酸；(3)具有3个或更少的二核苷酸重复序列；和(4)具有3个或更少的三核苷酸重复序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的saRNA，其中，所述saRNA包含正义链和反义链。
5.如权利要求1-4中任一项所述的saRNA，其中，所述寡核苷酸序列为所述saRNA的正义链或反义链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的saRNA，其中正义链和反义链各自包含互补区域，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
7.如权利要求4-6中任一项所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链具有至少90％的互补性。
8.如权利要求4所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链位于两条不同的核酸链上。
9.如权利要求4所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链位于连续的核酸链上，任选地为发夹式单链核酸分子，其中所述正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
10.如权利要求4所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链至少之一包括长度为0至6个核苷酸的3'突出端。
11.如权利要求10所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链包含长度为2至3个核苷酸的3'突出端。
12.如权利要求10所述的saRNA，其中，所述突出端的核苷酸中至少一个是选自或互补于UTRN基因上的相应核苷酸的核苷酸。
13.如权利要求4-12中任一项所述的saRNA，其中，所述正义链和反义链独立地包含约16至约35、约17至约30、约18至约25、或约19至约22个连续核苷酸的长度。
14.如权利要求4-12中任一项所述的saRNA，其中，所述正义链与选自SEQ ID NO:400-797的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性，并且所述反义链与选自SEQID NO:800-1197的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
15.如权利要求14所述的saRNA，其中，所述正义链包含选自SEQ ID NO:400-797的核苷酸序列，而所述反义链包含选自SEQ ID NO:800-1197的核苷酸序列。
16.如权利要求1所述的saRNA，其中，所述寡核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性或互补性。
17.如权利要求4所述的saRNA，其中，所述正义链与选自SEQ ID NO:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
18.如权利要求4所述的saRNA，其中，所述反义链与选自SEQ ID NO:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列互补性。
19.如权利要求1-18中任一项所述的saRNA，其中，所述saRNA的至少一个核苷酸是经化学修饰的核苷酸。
20.如权利要求19所述的saRNA，其中，所述saRNA的反义链和/或正义链的至少一个核苷酸经化学修饰。
21.如权利要求19所述的saRNA，其中，经化学修饰的核苷酸是具有以下至少一种修饰的核苷酸：
22.如权利要求19所述的saRNA，其中，所述saRNA的至少一个核苷酸是锁核酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、亚磷酰胺或包含非天然碱基的核苷酸。
23.如权利要求19所述的saRNA，其中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在正义链或反义链的5'端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。
24.如权利要求1-23中任一项所述的saRNA，其中，saRNA的正义链或反义链与选自脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体的一种或多种偶联部分偶联。
25.如权利要求24所述的saRNA，其中...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种小活化rna(sarna)，其包含长度范围为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列包含与seq id no:1200的等长部分具有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％同源性或互补性的连续核苷酸序列，其中所述sarna使utrn基因的表达相比utrn基因的基线表达上调至少10％。
2.如权利要求1所述的sarna，其中，seq id no:1200的等长部分位于utrn基因转录起始位点上游的区域-636至-496(seq id no:1207)、区域-351至-294(seqid no:1208)、区域-236至-187(seq id no:1209)或区域-101至-65(seq id no:1210)。
3.如权利要求1-2中任一项所述的sarna，其中，所述sarna(1)具有35％至70％的gc含量；(2)具有少于5个连续相同核苷酸；(3)具有3个或更少的二核苷酸重复序列；和(4)具有3个或更少的三核苷酸重复序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的sarna，其中，所述sarna包含正义链和反义链。
5.如权利要求1-4中任一项所述的sarna，其中，所述寡核苷酸序列为所述sarna的正义链或反义链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的sarna，其中正义链和反义链各自包含互补区域，其中正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
7.如权利要求4-6中任一项所述的sarna，其中，所述正义链和反义链具有至少90％的互补性。
8.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链位于两条不同的核酸链上。
9.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链位于连续的核酸链上，任选地为发夹式单链核酸分子，其中所述正义链和反义链的互补区域形成双链核酸结构。
10.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链和反义链至少之一包括长度为0至6个核苷酸的3'突出端。
11.如权利要求10所述的sarna，其中，所述正义链和反义链包含长度为2至3个核苷酸的3'突出端。
12.如权利要求10所述的sarna，其中，所述突出端的核苷酸中至少一个是选自或互补于utrn基因上的相应核苷酸的核苷酸。
13.如权利要求4-12中任一项所述的sarna，其中，所述正义链和反义链独立地包含约16至约35、约17至约30、约18至约25、或约19至约22个连续核苷酸的长度。
14.如权利要求4-12中任一项所述的sarna，其中，所述正义链与选自seq id no:400-797的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性，并且所述反义链与选自seqid no:800-1197的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
15.如权利要求14所述的sarna，其中，所述正义链包含选自seq id no:400-797的核苷酸序列，而所述反义链包含选自seq id no:800-1197的核苷酸序列。
16.如权利要求1所述的sarna，其中，所述寡核苷酸序列与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性或互补性。
17.如权利要求4所述的sarna，其中，所述正义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列同源性。
18.如权利要求4所述的sarna，其中，所述反义链与选自seq id no:1-398的核苷酸序列具有至少75％的序列互补性。
19.如权利要求1-18中任一项所述的sarna，其中，所述sarna的至少一个核苷酸是经化学修饰的核苷酸。
20.如权利要求19所述的sarna，其中，所述sarna的反义链和/或正义链的至少一个核苷酸经化学修饰。
21.如权利要求19所述的sarna，其中，经化学修饰的核苷酸是具有以下至少一种修饰的核苷酸：
22.如权利要求19所述的sarna，其中，所述sarna的至少一个核苷酸是锁核酸、无碱基核苷酸、2′-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、亚磷酰胺或包含非天然碱基的核苷酸。
23.如权利要求19所述的sarna，其中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在正义链或反义链的5'端添加(e)-乙烯基膦酸酯部分。
24.如权利要求1-23中任一项所述的sarna，其中，sarna的正义链或反义链与选自脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体的一种或多种偶联部分偶联。
25.如权利要求24所述的sarna，其中，所述sarna的正义链或反义链与选自细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖和n-乙酰半乳糖胺及其任意组合的一种或多种偶联部分偶联。
26.一种寡核苷酸调节剂，其包含如权利要求1-25中任一项所述的一种或多种sarna。
27.如权利要求26所述的寡核苷酸调节剂，其还包含与所述sarna偶联、组合或键合的一个或多个部分或组分。
28.如权利要求27所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述sarna的正义链和/或反义链与选自下组的一种或多种偶联部分偶联：脂质、脂肪酸、荧光团、配体、糖、肽和抗体。
29.如权利要求27所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述偶联部分各自独立地选自脂质、细胞穿透肽、聚乙二醇、生物碱、色胺、苯并咪唑、喹诺酮、氨基酸、胆固醇、葡萄糖、n-乙酰半乳糖胺及其任何组合。
30.如权利要求26所述的寡核苷酸调节剂，其中，所述寡核苷酸调节剂还包含与一个或多个其它活性部分偶联或结合的sarna，以用于utrn相关疾病或病症治疗，其中所述一个或多个其它活性部分各自独立地选自sarna、单链寡核苷酸、化学部分、多肽和抗体。
31.一种分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸包括权利要求1所述的连续核苷酸序列。
32.如权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸是选自seqidno:1-398的核酸序列。
33.一种分离的寡核苷酸复合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna的反义链和权利要求31-32中任一项所述的分离的多核苷酸。
34.如权利要求33所述的分离的寡核苷酸复合物，其中，所述分离的寡核苷酸复合物使utrn基因的表达相对于utrn基因的基线表达活化至少10％。
35.一种分离的核酸序列，其位于utrn基因转录起始位点上游，其中所述分离的核酸序列选自seq id no:1207-1210。
36.如权利要求35所述的分离的核酸序列，其中，所述分离的核酸序列包含权利要求31-32中任一项所述的分离的多核苷酸。
37.如权利要求35所述的分离的核酸序列，其中，靶向分离的核酸序列的设计的sarna中至少25％能使utrn基因的表达活化至少10％，其中所述设计的sarna(1)具有35％至70％的gc含量；(2)具有少于5个连续相同核苷酸；(3)具有3个或更少的二核苷酸重复序列；和(4)具有3个或更少的三核苷酸重复序列。
38.一种分离的核酸复合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna的反义链和权利要求35-37中任一项所述的分离的核酸序列的正义链。
39.如权利要求38所述的分离的核酸复合物，其中，所述分离的核酸复合物使utrn基因的表达相对于utrn基因的基线表达活化至少10％。
40.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-25中任一项所述的sarna。
41.如权利要求40所述的分离的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸是dna。
42.包含权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸的载体。
43.一种宿主细胞，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna、权利要求40-41中任一项所述的分离的多核苷酸，或权利要求42所述的载体。
44.一种组合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的sarna，或权利要求40或权利要求41所述的分离的多核苷酸，以及任选地，药学上可接受的运载体。
45.如权利要求44所述的组合物，其中，所述药学上可接受的运载体选自下组：水性运载体、脂质体、高分子聚合物、多肽和抗体。
46.如权利要求44或45所述的组合物，其中，所述组合物包含0.001-200nm的sarna。
47.如权利要求46所述的组合物，其中，所述组合物包含1-200nm的sarna。
48.一种sarna，其包含长度范围为16至35个连续核苷酸的寡核苷酸序列，用于活化/上...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜武林，罗伯特·普雷斯，李龙承，
申请(专利权)人：中美瑞康核酸技术南通研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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