【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及感染病原超多重大panel靶向扩增子测序试剂盒以及检测方法，属于基因检测。
技术介绍
1、病原微生物检测通常是对病人感染部位进行取样检查，判断感染的菌种。常用微生物检查标本类型众多，包括血液、尿、痰、胸水、腹水、各种分泌物、各种穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。此外，感染病原种类较多，根据核酸类型可分为dna病原和rna病原。宏基因组下一代测序技术(mngs)，是一种借助二代测序平台对从环境/临床样品中提取的全部微生物核酸序列进行快速测序，进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物种类的高通量测序方法，广泛应用于临床样本微生物组分析。相比传统培养方法，mngs拥有更高的敏感性以及更快的检测速度。尽管mngs用于临床病原诊断具有诸多优势，但其技术仍然面临着一些挑战：(1)病原检出结果易受样本中人源背景干扰；(2)对于胞内菌、真菌两类微生物检测灵敏性较低；(3)成本较高等。
2、靶向ngs测序在病原微生物检测中的优势包括：1)高灵敏度：靶向ngs测序可以检测到低拷贝数的病原微生物，提高了检测的灵敏度。2)高特异性：靶向ngs测序可以通过设计特定的引物来选择性地放大目标微生物的dna或rna序列，减少了非特异性检测结果的干扰。3)多样性检测：靶向ngs测序可以同时检测多种病原微生物，有助于快速准确地确定病原微生物的种类。4)快速性：靶向ngs测序可以在较短的时间内完成检测，有助于及时采取治疗措施。
3、但是靶向ngs测序的成功与否很大程度上取决于引物的设计，需要设计特异性高、覆盖度广
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于检测临床样本中病原微生物的多重引物组与方法，能够精准覆盖81种病原(包括24种细菌、10种真菌、6种dna病毒、22种rna病毒、8种分枝杆菌、5种寄生虫、3种支原体/衣原体、3种立克次体)和10个耐药基因，靶向扩增目标序列，放大病原体的信号，具有较高的灵敏度与特异性，可实现病原体更为精准的广谱检测。
2、用于检测病原微生物的多重引物组，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组的引物：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大芬戈尔德菌、人葡萄球菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌、鹑鸡肠球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、钩端螺旋体、惠普尔养障体、产黑素普雷沃菌、铜绿假单胞菌、头状葡萄球菌、皮诺卡菌、纹带棒状杆菌、鲍曼不动杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、生殖支原体、解脲脲原体、鹦鹉热衣原体、横塞氏巴尔通氏体、普氏立克次氏体、伤寒立克次氏体、季也蒙念珠菌、马尔尼菲篮状菌、耶氏肺孢子菌、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、小孢根霉、烟曲霉、结核分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、土分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、粘液分枝杆菌、阴道毛滴虫、内阿米巴、疟原虫、棘球蚴、巴氏阿米巴原虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人巨细胞病毒、eb病毒、腺病毒b、人细小病毒b19、乙型脑炎病毒、冠状病毒229e、甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、甲型流感病毒h5n1、甲型流感病毒h7n9、鼻病毒a101型、鼻病毒a24型、鼻病毒a1b型、鼻病毒b6型、鼻病毒b27型、鼻病毒c20型、鼻病毒c34型、鼻病毒c11、鼻病毒c17、人副流感病毒1、人副流感病毒2、人副流感病毒3、人副流感病毒4、新型冠状病毒sars-cov-2、风疹病毒、轮状病毒a；
3、还包括用于特异性扩增以下耐药基因区域：ctx-m、imp、kpc、ndm、oxa-23、oxa-24、oxa-48、oxa-51、vim、meca。
4、多重引物组如seq id no:1-251所示序列，或者具有相同功能的序列。
5、所述的具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。
6、检测病原微生物的方法，包括如下步骤：
7、获得临床患者的样本，进行dna和rna总核酸的提取；
8、总核酸经反转录后，采用上述多重引物组进行多重pcr反应；
9、反应产物经第二轮pcr形成完整文库，并进行下一代测序。
10、所述的反转录反应中的反应体系包括：总核酸7μl，random primer 1μl，1μlreaction buffer，1μl 1st strand enzyme mix，总体积10μl。
11、反转录的反应程序为70℃孵育5min；25℃退火5min；37℃延伸45min；85℃酶灭活5s。
12、所述的多重pcr反应中的反应体系包括：cdna模板9μl，多重引物组工作液6μl，hg multiplex pcr master mix 15μl，总体积30μl。
13、多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s；60℃退火延伸2min；扩增26个循环；72℃终延伸5min。
14、有益效果
15、本专利技术提供的病原检测试剂盒能够实现对81种不同病原体的同时检测，具有灵敏性好、特异性高的优点。
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1.用于检测病原微生物的多重引物组，其特征在于，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组的引物：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大芬戈尔德菌、人葡萄球菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌、鹑鸡肠球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、钩端螺旋体、惠普尔养障体、产黑素普雷沃菌、铜绿假单胞菌、头状葡萄球菌、皮诺卡菌、纹带棒状杆菌、鲍曼不动杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、生殖支原体、解脲脲原体、鹦鹉热衣原体、横塞氏巴尔通氏体、普氏立克次氏体、伤寒立克次氏体、季也蒙念珠菌、马尔尼菲篮状菌、耶氏肺孢子菌、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、小孢根霉、烟曲霉、结核分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、土分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、粘液分枝杆菌、阴道毛滴虫、内阿米巴、疟原虫、棘球蚴、巴氏阿米巴原虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒B、人细小病毒B19、乙型脑炎病毒、冠状病毒229E、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、甲型流感病毒H5N1、甲型流感
2.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的多重引物组，其特征在于，多重引物组如SEQ ID NO:1-272所示序列，或者具有相同功能的序列。
3.根据权利要求2所述的用于检测病原微生物的多重引物组，其特征在于，所述的具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。
4.检测病原微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反转录反应中的反应体系包括：总核酸7μL，Random Primer 1μL，1μL Reaction Buffer，1μL 1st Strand Enzyme Mix，总体积10μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反转录的反应程序为70℃孵育5min；25℃退火5min；37℃延伸45min；85℃酶灭活5s。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的多重PCR反应中的反应体系包括：cDNA模板9μL，多重引物组工作液6μL，HG Multiplex PCR Master Mix 15μL，总体积30μL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；
...【技术特征摘要】
1.用于检测病原微生物的多重引物组，其特征在于，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组的引物：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大芬戈尔德菌、人葡萄球菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌、鹑鸡肠球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、钩端螺旋体、惠普尔养障体、产黑素普雷沃菌、铜绿假单胞菌、头状葡萄球菌、皮诺卡菌、纹带棒状杆菌、鲍曼不动杆菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、生殖支原体、解脲脲原体、鹦鹉热衣原体、横塞氏巴尔通氏体、普氏立克次氏体、伤寒立克次氏体、季也蒙念珠菌、马尔尼菲篮状菌、耶氏肺孢子菌、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、小孢根霉、烟曲霉、结核分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、土分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、粘液分枝杆菌、阴道毛滴虫、内阿米巴、疟原虫、棘球蚴、巴氏阿米巴原虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人巨细胞病毒、eb病毒、腺病毒b、人细小病毒b19、乙型脑炎病毒、冠状病毒229e、甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、甲型流感病毒h5n1、甲型流感病毒h7n9、鼻病毒a101型、鼻病毒a24型、鼻病毒a1b型、鼻病毒b6型、鼻病毒b27型、鼻病毒c20型、鼻病毒c34型、鼻病毒c11、鼻病毒c17、人副流感病毒1、人副流感病毒2、...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，郭垚，朱淼，张虎，梁相志，蒋文，
申请(专利权)人：迪飞医学科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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