【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、腺相关病毒（aav）载体已经广泛用于基因疗法以将治疗性基因转移至靶位点，这部分是由于它们的宽宿主范围、低免疫原性和细胞毒性以及长期表达。事实上，近期研究已经证实了aav载体用于矫正单基因障碍和疾病的功效。
2、临床aav载体的未解决的问题是由于衣壳向性和启动子活性的非特异性所致的脱靶转基因表达。因此，需要提供更高细胞类型特异性和可控表达二者的重组aav载体用于更精确靶向的基因疗法。本专利技术满足了这些需求。
技术实现思路
1、如本文所述，本公开文本的专利技术涉及重组aav载体，所述重组aav载体包含与肌肉特异性启动子可操作地连接的诱导型转录激活子。在某些实施方案中，所述aav载体还包含对肌肉组织具有特异性的衣壳基因。在某些方面，本公开文本的专利技术还包括产生并使用所述重组aav载体以将转基因引入靶细胞中并治疗有需要的受试者的疾病的方法。
2、在一个方面，本专利技术提供一种重组aav载体，所述重组aav载体包含有效载荷转基因。在某些实施方案中，所述有效载荷转基因与诱导型转录激活子可操作地连接。在某些实施方案中，所述诱导型转录激活子与肌肉特异性启动子可操作地连接。在某些实施方案中，所述重组aav载体还包含对肌肉组织具有特异性的衣壳基因。
3、在某些实施方案中，所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
4、在某些实施方案中，所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
5、在某些实施方案中，所述修饰的syn
6、在某些实施方案中，所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
7、在某些实施方案中，所述四环素药剂是四环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是多西环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是脱水四环素。
8、在某些实施方案中，所述对肌肉组织具有特异性的衣壳基因是基于aav9衣壳基因。
9、在另一个方面，本专利技术提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含aav载体。在某些实施方案中，所述载体包含有效载荷转基因。在某些实施方案中，所述有效载荷转基因与诱导型转录激活子可操作地连接。在某些实施方案中，所述诱导型转录激活子与肌肉特异性启动子可操作地连接。在某些实施方案中，所述aav载体还包含对肌肉组织具有特异性的衣壳基因。
10、在某些实施方案中，所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
11、在某些实施方案中，所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
12、在某些实施方案中，所述修饰的syn启动子包括mck增强子。
13、在某些实施方案中，所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
14、在某些实施方案中，所述四环素药剂是四环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是多西环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是脱水四环素。
15、在某些实施方案中，所述对肌肉组织具有特异性的衣壳基因是基于aav9衣壳基因。
16、在另一个方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物包含本公开文本的重组aav载体，以及本文公开的任何方面或实施方案。
17、在另一个方面，本专利技术提供一种将转基因引入靶细胞中的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使永生化细胞与本公开文本的重组aav载体和一种或多种辅助质粒接触，从而产生包装细胞。在某些实施方案中，所述方法包括培养所述包装细胞以产生aav载体颗粒。在某些实施方案中，所述方法包括分离并纯化所述aav载体颗粒的至少一部分。在某些实施方案中，所述方法包括使所述靶细胞与有效量的所述aav载体颗粒接触，从而将所述转基因引入所述靶细胞中。在某些实施方案中，所述方法包括用有效量的其四环素药剂处理所述靶细胞。
18、在某些实施方案中，所述靶细胞是肌细胞。
19、在某些实施方案中，所述四环素药剂是四环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是多西环素。在某些实施方案中，所述四环素药剂是脱水四环素。
20、在某些实施方案中，所述永生化细胞是hek293细胞。在某些实施方案中，所述永生化细胞是缺少大的t元件的hek293细胞。在某些实施方案中，所述永生化细胞是hela细胞。在某些实施方案中，所述永生化细胞是cho细胞。在某些实施方案中，所述永生化细胞是htert永生化细胞。
21、在另一个方面，本专利技术提供一种治疗、改善和/或预防有需要的受试者的疾病的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上文方面和实施方案中的任一个或本文公开的任何方面或实施方案的组合物，以及向所述受试者进一步施用有效量的四环素药剂。
22、在某些实施方案中，所述转基因的表达矫正和/或改善内源基因的功能障碍。
23、在某些实施方案中，所述疾病与内源基因的功能障碍有关。
24、在某些实施方案中，所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
25、在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。
26、在某些实施方案中，所述受试者是人。
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1.一种重组AAV载体，所述重组AAV载体包含有效载荷转基因，
2.根据权利要求1所述的重组AAV载体，其中所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
3.根据权利要求2所述的重组AAV载体，其中所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
4.根据权利要求3所述的重组AAV载体，其中所述修饰的syn启动子包括Mck增强子。
5.根据权利要求1所述的重组AAV载体，其中所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
6.根据权利要求5所述的重组AAV，其中所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
7.根据权利要求1所述的重组AAV，其中所述对肌肉组织具有特异性的衣壳基因是基于AAV9衣壳基因。
8.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含AAV载体，
9.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
10.根据权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
11.根据权利要
12.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
13.根据权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
14.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述对肌肉组织具有特异性的衣壳基因是基于AAV9衣壳基因。
15.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7中任一项所述的重组AAV载体。
16.一种将转基因引入靶细胞中的方法，所述方法包括：
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述靶细胞是肌细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述永生化细胞选自HEK293细胞、缺少大的T元件的HEK293细胞、HeLa细胞、CHO细胞和hTERT永生化细胞。
20.一种治疗、改善和/或预防有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求15所述的组合物，以及向所述受试者进一步施用有效量的四环素药剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述转基因的表达矫正和/或改善内源基因的功能障碍。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病与内源基因的功能障碍有关。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者是人。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种重组aav载体，所述重组aav载体包含有效载荷转基因，
2.根据权利要求1所述的重组aav载体，其中所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
3.根据权利要求2所述的重组aav载体，其中所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
4.根据权利要求3所述的重组aav载体，其中所述修饰的syn启动子包括mck增强子。
5.根据权利要求1所述的重组aav载体，其中所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
6.根据权利要求5所述的重组aav，其中所述四环素药剂选自四环素、多西环素和脱水四环素。
7.根据权利要求1所述的重组aav，其中所述对肌肉组织具有特异性的衣壳基因是基于aav9衣壳基因。
8.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含aav载体，
9.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述肌肉特异性启动子是杂合肌肉特异性启动子。
10.根据权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述杂合肌肉特异性启动子是修饰的syn启动子。
11.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述修饰的syn启动子包括mck增强子。
12.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述诱导型转录激活子是四环素药剂诱导型启动子。
13.根据权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述四环素药剂选自四环素、...
【专利技术属性】
技术研发人员：周仁平，
申请(专利权)人：罗格斯新泽西州立大学，
类型：发明
国别省市：
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