【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物检测，涉及一组igg n-糖肽生物标志物组合及其用途。尤其是一组igg n-糖肽生物标志物组合及其在制备评估肝类疾病恶化程度的试剂或试剂盒中的用途，
技术介绍
1、据资料记载，肝脏疾病是困扰我国人群的主要疾病之一，亟需筛选生物标志物用于早期的临床检测和诊断。目前，常用的肝脏疾病诊断方法包括血清检测、影像学检查和活组织检查等，但这些方法存在一定的局限性，如敏感性低、特异性差、侵入性强或成本高等。因此，寻找新型的肝脏疾病生物标志物具有重要的临床意义。近年来，基于质谱的定量糖蛋白组学阐明了糖基化修饰/糖蛋白在生理和病理过程中的作用，并逐渐成为一种筛选潜在生物标志物的重要方法。
2、免疫球蛋白g(immunoglobulin g，igg)是人血浆中最丰富的免疫球蛋白，占总免疫球蛋白的75％以上，分为igg1、igg2、igg3和igg4四种亚型。igg通过其可变区(fab)识别和结合抗原，通过其恒定区(fc)与受体或补体相互作用，参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)、补体依赖性细胞溶解作用(cdc)等免疫效应，清除外来病原体或异物。igg的fc区存在一个保守的n-糖基化位点(asn297)，其n-糖链结构和组成可以影响igg的构象和功能，调节其与受体或补体的亲和力和活性。igg n-糖基化在不同的生理和病理状态下有不同的变化，反映了机体免疫系统的平衡和功能。例如，igg fc区的半乳糖基化水平与自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等密切相关，半乳糖基化水平降低会增强igg的促炎作用，而半乳糖基化水平升高
3、基于现有技术的现状，位点特异地分析igg四个亚型的n-糖链结构和组成对相关疾病的发生机制、诊断标准、治疗效果及预后评估将具有重要意义。因此，本专利技术拟提供一组igg n-糖肽生物标志物组合及其用途；具体的，igg n-糖基化可以作为一种新型的生物标志物，用于疾病的早期检测、诊断、治疗和监测。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于评估肝类疾病恶化进程的标志物组合，为临床上肝类疾病的诊治提供了新思路，具体的，本专利技术提供一组igg n-糖肽生物标志物组合及其在制备评估肝类疾病恶化程度的试剂或试剂盒中的用途。本专利技术的技术方案具有高效、准确、灵敏、低成本和微创等优点，对于早期发现和预防肝类疾病恶化进程具有重要意义，使之更适合于精准医学的临床应用。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供一组生物标志物组合在制备评估肝类疾病恶化程度的试剂或试剂盒的用途，所述生物标志物组合为10条igg n-糖肽组合，所述10条igg n-糖肽组合包括
4、igg34-h4n4,igg1-h3n4f1,igg2-h6n3f1,igg2-h3n3f1,igg1-h4n4f1,igg2-h5n5s1,igg2-h4n5,igg1-h4n5f1,igg1-h3n5f1,以及igg34-h4n5f1，其中igg1亚型多肽序列为eeqynstyr，igg2亚型多肽序列为eeqfnstfr，igg34亚型多肽序列为eeqynstfr，n代表hexnac己糖胺残基，h代表hex己糖残基，f代表fuc岩藻糖残基，s-neuac唾液酸残基，数字代表单糖残基的个数。
5、优选地，所述igg n-糖肽的糖型是在igg1亚型多肽、igg2亚型多肽序列、或igg34亚型多肽序列asn位点上的糖基化修饰。
6、优选地，所述igg n-糖肽组合在严重肝类疾病患者的血清或血浆中的含量相对于轻度或非肝类疾病组患者血清或血浆中的含量上调，其中所述严重肝类疾病指肝癌与肝硬化，轻度肝类疾病指肝炎，非肝类疾病指健康对照。
7、本专利技术第二方面提供用于检测本专利技术第一方面所述的igg n-糖肽组合的试剂在制备用于评估肝病恶化程度的试剂盒中的应用。
8、本专利技术第三方面提供一种检测本专利技术第一方面所述的igg n-糖肽组合在血清或血浆中的含量的方法，包括：(1)血清样品的收集；(2)血清免疫球蛋白g(igg)的纯化与酶解；(3)igg n-糖肽样品前处理；(4)lc-ms/ms分析与igg n-糖肽相对定量；(5)差异分析和机器学习。
9、优选地，所述步骤(1)：采集血清样本，并将其保存在-80℃的冰箱中；所述步骤(2)：血清样本解冻，通过protein g-琼脂糖从血清中纯化得到igg蛋白；使用市售的bca定量试剂盒测定纯化得到的igg蛋白浓度，进行igg蛋白还原烷基化，后加入胰蛋白酶酶解，终止酶解后干燥，以进行下一步的质谱检测；
10、所述步骤(3)：对所有样品中的igg肽段进行tmt标记处理(thermo fisherscientific)，通过zic-hilic富集完整糖肽，将收集到的洗脱液冻干；
11、所述步骤(4)：是利用orbitrap exploris 480质谱仪检测步骤(3)中的血清样本，一级扫描范围为350-2000m/z；
12、所述步骤(5)：使用r(version4.2.2)对严重肝类疾病患者以及轻度或非肝类疾病组患者组别之间的igg n-糖肽进行显著差异比较：使用t检验(t-test)对严重肝类疾病患者以及轻度或非肝类疾病组患者血清或血浆中的所有糖肽相对含量进行显著性差异分析。
13、优选地，所述步骤(2)包括：
14、(a)血清样本在4℃解冻；
15、(b)通过protein g-琼脂糖从血清中纯化得到igg蛋白；
16、(c)使用市售的bca定量试剂盒(thermo fisher scientific)测定纯化得到的igg蛋白浓度。
17、(d)取第(3)中所述的每例样品各100μg蛋白，用100mm四乙基溴化铵(teab)稀释至1μg/μl。
18、(e)igg蛋白还原烷基化：向100μg蛋白中加入终浓度为15mm二硫苏糖醇(dtt)，在56℃条件下进行还原反应30min。而后向上述混合物中加入终浓度为30mm碘乙酰胺(iaa)进行烷基化反应，室温避光45min。
19、(f)甲醇氯仿沉淀：完成还原烷基化的igg蛋白溶液进行甲醇-氯仿沉淀以除去多余的dtt与iaa。按照溶液体积比为1:4:1:3(蛋白溶液：甲醇：氯仿：水)加入试剂后振荡混合，然后离心(15000rcf，20℃，20min)。弃去上层溶液，置于通风橱中自然风干2-3min后可进行酶解。
20、(g)igg蛋白酶解：加入100μl 100mm teab，以质量比1:50(酶:蛋白)加入胰蛋白酶(trypsin)，37℃过夜酶解。次日，向酶解后的肽段溶液中加入三氟乙酸(tfa，终浓度为0.5％)以终止酶解。c18除盐柱(50mg，waters)除去多余盐份后在旋转真空浓缩器(christ，德国)上干燥。
21、所述步骤(3)包括：
22、(a)tm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组生物标志物组合在制备评估肝类疾病恶化程度的试剂或试剂盒的用途，所述生物标志物组合为10条IgG N-糖肽组合，所述10条IgG N-糖肽组合包括
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述IgG N-糖肽的糖型是在IgG1亚型多肽、IgG2亚型多肽序列、或IgG34亚型多肽序列Asn297号位点上的糖基化修饰。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物组合在严重肝类疾病患者的血清或血浆中的含量相对于轻度或非肝类疾病患者上调，其中所述严重肝类疾病指肝癌与肝硬化，轻度肝类疾病指肝炎，非肝类疾病指健康对照。
4.检测IgG N-糖肽组合的试剂在制备用于评估肝类疾病恶化程度的试剂盒中的应用，其中所述IgG N-糖肽组合包括IgG34-H4N4,IgG1-H3N4F1,IgG2-H6N3F1,IgG2-H3N3F1,IgG1-H4N4F1,IgG2-H5N5S1,IgG2-H4N5,IgG1-H4N5F1,IgG1-H3N5F1,以及IgG34-H4N5F1，其中IgG1亚型多肽序列为EEQYNSTYR，IgG2亚型多肽序列为EE
5.一种筛查IgG N-糖肽组合在血清或血浆中的含量的方法，包括：(1)血清样品的收集；(2)血清免疫球蛋白G(IgG)的纯化与酶解；(3)IgG N-糖肽样品前处理；(4)LC-MS/MS分析与IgG N-糖肽相对定量；(5)差异分析和机器学习；其中所述IgG N-糖肽组合包括IgG34-H4N4,IgG1-H3N4F1,IgG2-H6N3F1,IgG2-H3N3F1,IgG1-H4N4F1,IgG2-H5N5S1,IgG2-H4N5,IgG1-H4N5F1,IgG1-H3N5F1以及IgG34-H4N5F1，其中IgG1亚型多肽序列为EEQYNSTYR，IgG2亚型多肽序列为EEQFNSTFR，IgG34亚型多肽序列为EEQYNSTFR，糖型中的N代表HexNAc己糖胺残基，H代表Hex己糖残基，F代表Fuc岩藻糖残基，S-NeuAc唾液酸残基，数字代表单糖残基的个数。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中包括采集血清样本，并将其保存在-80℃的冰箱中。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中包括：血清样本解冻，通过protein G-琼脂糖从血清中纯化得到IgG蛋白；使用市售的BCA定量试剂盒测定纯化得到的IgG蛋白浓度，进行IgG蛋白还原烷基化，后加入胰蛋白酶酶解，终止酶解后干燥，以进行下一步的质谱检测。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中包括：对所有样品中的IgG肽段进行TMT标记处理(Thermo Fisher Scientific)，通过ZIC-HILIC富集完整糖肽，将收集到的洗脱液冻干。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中包括：利用OrbitrapExploris 480质谱仪检测步骤(3)中的血清样本，一级扫描范围为350-2000m/z。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中包括：使用R(version4.2.2)对严重肝类疾病患者以及轻度或非肝类疾病组患者组别之间的IgG N-糖肽组合进行显著差异比较：使用T检验(T-test)对严重肝类疾病患者以及轻度或非肝类疾病组患者血清或血浆中的IgG N-糖肽组合相对含量进行显著性差异分析。
...【技术特征摘要】
1.一组生物标志物组合在制备评估肝类疾病恶化程度的试剂或试剂盒的用途，所述生物标志物组合为10条igg n-糖肽组合，所述10条igg n-糖肽组合包括
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述igg n-糖肽的糖型是在igg1亚型多肽、igg2亚型多肽序列、或igg34亚型多肽序列asn297号位点上的糖基化修饰。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物组合在严重肝类疾病患者的血清或血浆中的含量相对于轻度或非肝类疾病患者上调，其中所述严重肝类疾病指肝癌与肝硬化，轻度肝类疾病指肝炎，非肝类疾病指健康对照。
4.检测igg n-糖肽组合的试剂在制备用于评估肝类疾病恶化程度的试剂盒中的应用，其中所述igg n-糖肽组合包括igg34-h4n4,igg1-h3n4f1,igg2-h6n3f1,igg2-h3n3f1,igg1-h4n4f1,igg2-h5n5s1,igg2-h4n5,igg1-h4n5f1,igg1-h3n5f1,以及igg34-h4n5f1，其中igg1亚型多肽序列为eeqynstyr，igg2亚型多肽序列为eeqfnstfr，igg34亚型多肽序列为eeqynstfr，糖型中的n代表hexnac己糖胺残基，h代表hex己糖残基，f代表fuc岩藻糖残基，s-neuac唾液酸残基，数字代表单糖残基的个数。
5.一种筛查igg n-糖肽组合在血清或血浆中的含量的方法，包括：(1)血清样品的收集；(2)血清免疫球蛋白g(igg)的纯化与酶解；(3)igg n-糖肽样品前处理；(4)lc-ms/ms分析与igg n-糖肽相对定量；(5)差异分析和机器学习；其中所述igg n-糖肽组合包括igg34-h4n4,igg1-h3n4f1,igg2-h6n3f1,igg2-h3n3f1,...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆豪杰，张莹，刘雪娇，付彬，
申请(专利权)人：粤港澳大湾区精准医学研究院广州，
类型：发明
国别省市：
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