【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库及其制备方法和应用。
技术介绍
1、新城疫(nd)是由新城疫病毒(ndv)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病。目前，在生产实践中典型性的新城疫已得到较好的控制，但局部地区病毒污染比较严重，疫情呈持续性地方流行。近年来，虽然nd疫苗的广泛使用，使疫病的爆发流行明显减少，但该病呈现出新的流行特点，如出现了非典型性症状、免疫带毒、免疫失败、区域流行以及混合感染等流行新特点，使新城疫防控复杂化，直接及间接造成的经济损失巨大，防控面临着新挑战，寻求防控nd已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。更值得关注的是，临床上缺乏免疫禽群中出现非典型性症状的针对性防治产品。因此，研制安全、高效、廉价、易于标准化的生物治疗制剂已成为当务之急。
2、纳米抗体是仅由单独的重链抗体可变区(vhh)构成的抗体片段，且只展现出最小的功能性抗原结合活性区域，其具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强、亲和力高、溶解性好、组织渗透性强以及可识别抗原缝隙表位、易于基因改造、生产成本低、形式模块化、免疫原性弱等特点，表现出更好的应用价值。这些优势使得纳米抗体成为开发新型生物治疗制剂的热点和趋势。
3、纳米抗体结构域包含4个保守的框架区(fr)、3个高变的互补决定区(cdr)。目前，关于纳米抗体文库主要包括天然库、免疫库和随机合成库，每种文库适合不同的抗原也存在不同的优缺点。本实验室前期研究发现，不同抗原免疫产生的文库，其vhh序列也存在较大差异，主要表现在cdr1
4、目前，尚无关于针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库及其制备方法和应用，以填补新城疫病毒纳米抗体相关随机组合文库的空白。
2、本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，根据新城疫病毒纳米文库中vhh序列信息，设计3对针对纳米抗体中互补决定区的引物，利用设计的引物分别扩增获得具有同源臂的cdr1区域、cdr2区域和cdr3区域，通过同源重组技术将其串联并插入至噬菌体展示质粒pcomb3xss，电转化至大肠杆菌tg1感受态中，获得针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库。
4、其中，所述3对针对纳米抗体中互补决定区的引物分别为：引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6；
5、引物1：gagctcgatgtgcagctggtg；
6、引物2：gaccaattcacgctg；
7、引物3：tggcaccgccaggct；
8、引物4：aggtttcagattgttcattt；
9、引物5：gattcttcctctccagag；
10、引物6：actagttgaggagacggtgac。
11、其中，本专利技术所构建的随机组合文库的阳性率为87.5％，库容量为1×109个。
12、本专利技术提供一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，主要包括以下步骤：
13、根据新城疫病毒纳米文库中vhh序列信息，设计3对针对纳米抗体中互补决定区的引物，引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6；利用引物1和引物2扩增出含有cdr1区的片段，利用引物3和引物4扩增出含有cdr2区的片段，利用引物5和引物6扩增出含有cdr3区的片段；以cdna为模板，采用pcr法分别扩增上述3个片段，将回收的3个片段通过同源重组酶连接，随后与噬菌体展示质粒pcomb3xss分别经限制性内切酶sac i和spe i消化处理，用t4连接酶连接并电转化至大肠杆菌tg1感受态中，次日挑取多个单菌落，进行菌液pcr，经鉴定后表明针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库构建成功。
14、其中，所述引物的序列信息如下：
15、引物1：gagctcgatgtgcagctggtg；
16、引物2：gaccaattcacgctg；
17、引物3：tggcaccgccaggct；
18、引物4：aggtttcagattgttcattt；
19、引物5：gattcttcctctccagag；
20、引物6：actagttgaggagacggtgac。
21、其中，所述引物1和引物6分别包含sac i和spe i酶切位点序列。
22、其中，所述cdna的序列为seq id no:7。
23、其中，所述回收的3个片段的序列分别为seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10。
24、本专利技术提供一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库在新城疫病毒纳米抗体的筛选与鉴定中的应用，其具体包括以下步骤：
25、将新城疫病毒vii-nj株包被酶标板后，采用抗体库固相筛选技术筛选能与新城疫病毒结合的vhh序列，固相筛淘的elisa检测结果显示，针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库中能与新城疫病毒结合的纳米抗体的阳性率为74％(37/50)。
26、本专利技术的有益效果是：
27、本专利技术构建了一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，该随机组合文库的阳性率为87.5％(21/24)，库容量为1×109个，经筛淘后，能与新城疫病毒结合的纳米抗体的阳性率为74％(37/50)，具有更高的库容量和更多的特异性纳米抗体，对新城疫防控用生物材料筛选和病毒学研究奠定基础。
28、其优点如下：
29、1、本专利技术的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的阳性率为87.5％(21/24)，库容量为1×109个，而相比于普通文库，其阳性率为83.33％(20/24)，库容量为3×108个，随机组合文库具有更高的库容量。
30、2、本专利技术的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，经筛淘后，能与新城疫病毒结合的纳米抗体的阳性率为74％(37/50)，而相比于普通文库，能与新城疫病毒结合的纳米抗体的阳性率为54％(27/50)，随机组合文库具有更多的特异性纳米抗体。
31、3、本专利技术的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法是针对纳米抗体中互补决定区(cdr)进行截短pcr扩增，设计的引物具有vhh文库特异性，该策略属首次公开。
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1.一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，根据新城疫病毒纳米文库中VHH序列信息，设计3对针对纳米抗体中互补决定区的引物，利用设计的引物分别扩增获得具有同源臂的CDR1区域、CDR2区域和CDR3区域，通过同源重组技术将其串联并插入至噬菌体展示质粒pComb3XSS，电转化至大肠杆菌TG1感受态中，获得针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库。
2.根据权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，所述3对针对纳米抗体中互补决定区的引物分别为：引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6；
3.根据权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，所述随机组合文库的阳性率为87.5％，库容量为1×109个。
4.如权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，其特征在于，所述引物的序列信息如下：
6.根据权利要求4所述的一种针对新城疫病毒纳
7.根据权利要求4所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，其特征在于，所述cDNA的序列为SEQ ID NO:7。
8.根据权利要求4所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，其特征在于，所述回收的3个片段的序列分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。
9.如权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库在新城疫病毒纳米抗体的筛选与鉴定中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，根据新城疫病毒纳米文库中vhh序列信息，设计3对针对纳米抗体中互补决定区的引物，利用设计的引物分别扩增获得具有同源臂的cdr1区域、cdr2区域和cdr3区域，通过同源重组技术将其串联并插入至噬菌体展示质粒pcomb3xss，电转化至大肠杆菌tg1感受态中，获得针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库。
2.根据权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，所述3对针对纳米抗体中互补决定区的引物分别为：引物1和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6；
3.根据权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库，其特征在于，所述随机组合文库的阳性率为87.5％，库容量为1×109个。
4.如权利要求1所述的一种针对新城疫病毒纳米抗体的随机组合文库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：钱晶，耿正扬，史若然，张燕飞，陈鹏举，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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