【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因药物，尤其涉及长岛型掌跖角化症治疗药物制备技术。
技术介绍
1、长岛型掌跖角化症(nagashima-type palmoplantar keratosisi，nppk)是serpinb7基因突变引起的常染色体隐性遗传性掌跖角化病。该基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂serpinb7蛋白，特异性在表皮角质层和颗粒层细胞中表达。serpinb7蛋白发挥正常功能有赖于其核心功能区的完整性，而维持蛋白功能的活性位点环对应其c端第331-352位氨基酸。已发现的nppk致病突变类型多数会导致终止密码子提前出现，引发serpinb7翻译提前终止，产生截短蛋白，导致serpinb7蛋白的活性位点环丢失，导致疾病发生。已报道的nppk致病突变中，serpinb7 c.796c>t突变频率最高，在亚洲人中最常见。目前，尚无针对nppk的特异性疗法，临床一般采用口服阿维a及局部浅层x线照射、外用维甲酸、角质剥脱剂或润肤剂等，局部使用庆大霉素可改善角化过度和臭味等方式进行治疗。但是这些局部治疗仅表现出短暂的疗效，大多数患者停药后复发。作为一种单基因隐性遗传病，nppk最佳的治疗方法是对基因突变位点进行精准地纠正，进而修复皮肤屏障缺陷。
2、基因编辑主要因素之一是工具酶。crispr/cas9系统是近年来兴起的新型基因编辑工具，基于其操作简单、高效性的特点，其已经在疾病的治疗中显示出了巨大的应用潜力。crispr/cas9系统主要由两部分组成，分别为sgrna和cas9，二者形成复合体，sgrna与靶位点dna通过碱基互补
3、基因编辑另一主要因素是基因的递送系统。单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，hsv)作为溶瘤病毒已在多项临床研究中使用，并已获得批准应用于临床，其对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，具有外源基因容量大、安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、表达时间长及稳定等优点。因ⅰ型单纯疱疹病毒hsv-1具有天然的嗜上皮特性，近年来其在遗传性皮肤病中的应用受到关注，主要作为载体导入外源基因，促进靶蛋白在特定细胞亚群中的正常表达。然而，hsv-1介导的过表达策略需要多次给药以维持治疗效果，易诱发临床相关免疫反应，且外源性基因异位过表达可能会引起潜在的风险。若能成功研发crispr/cas9基因编辑技术联合单纯疱疹病毒载体系统，将是实现精准且长久修复遗传性皮肤病的基因突变的一大进步。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna、复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统及制备方法与应用，以解决缺少有效的长岛型掌跖角化症治疗药物的问题。
2、为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
3、一种靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna，命名为mutsgrna，其序列如seq idno.1所示。
4、本专利技术还提供一种所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
5、本专利技术还提供一种含有所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体。
6、本专利技术还提供一种含有所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
7、更优地，所述复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体是bac-hsv1-δir-δicp4-δicp22-serpinb7-mutsgrna-krt5-cas9-ampr质粒。
8、本专利技术还提供一种含所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统的制备方法，过程包括：
9、敲除bac-hsv1-δir-δicp4病毒基因组中的icp22基因，得到bac-hsv1-δir-δicp4-δicp22病毒基因组；
10、bac-hsv1-δir-δicp4-δicp22病毒基因组敲入serpinb7正常链、u6启动子调控的mutsgrna、角蛋白5条件性启动子调控的cas9基因、氨苄青霉素抗性基因，得到bac-hsv1-δir-δicp4-δicp22-serpinb7-mutsgrna-krt5-cas9-ampr病毒基因组，为复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体；
11、复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体转染icp4-egfp及icp22-3×flag-cre过表达vero细胞，体外包装重组病毒，得到复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统。
12、本专利技术还提供一种所述的制备方法得到的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统。
13、本专利技术还提供一种所述的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
14、本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
15、使用sds-page凝胶电泳及脱靶检测评估靶向点突变sgrna的特异性，靶向点突变的mutsgrna特异性识别切割点突变基因组而不切割野生型的基因组，通过sanger测序及深度测序评估hr方法的点突变碱基校正效率，并在细胞功能水平上评估hr的有效编辑性，该条sgrna无脱靶风险；同源重组方法基因编辑的碱基纠正效率为84.99％，且点突变细胞经hr途径基因编辑后在功能上有所恢复。本专利技术还对hsv-1载体进行优化，通过敲除hsv-1基因组的复制相关基因icp4和icp22，同时敲入上皮组织特异性启动子keratin 5表达调控的cas9、sgrna及serpinb7正常链基因同源重组模板，在体外包装复制缺陷型hsv-1病毒，得到了可行有效的递送系统。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种靶向SERPINB7 c.796C>T点突变的sgRNA，命名为MUTsgRNA，其序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种如权利要求1所述靶向SERPINB7 c.796C>T点突变的sgRNA在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
3.一种含有如权利要求1所述靶向SERPINB7 c.796C>T点突变的sgRNA的复制缺陷型Ⅰ型单纯疱疹病毒载体。
4.一种含有如权利要求1所述靶向SERPINB7 c.796C>T点突变的sgRNA的复制缺陷型Ⅰ型单纯疱疹病毒载体在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述复制缺陷型Ⅰ型单纯疱疹病毒载体是BAC-HSV1-ΔIR-ΔICP4-ΔICP22-SERPINB7-MUTsgRNA-KRT5-Cas9-AmpR质粒。
6.一种含如权利要求1所述靶向SERPINB7 c.796C>T点突变的sgRNA的复制缺陷型Ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统的制备方法，其特征在于：
7.一种如权
8.一种如权利要求7所述的复制缺陷型Ⅰ型单纯疱疹病毒载体递送系统在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna，命名为mutsgrna，其序列如seq idno.1所示。
2.一种如权利要求1所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
3.一种含有如权利要求1所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体。
4.一种含有如权利要求1所述靶向serpinb7 c.796c>t点突变的sgrna的复制缺陷型ⅰ型单纯疱疹病毒载体在制备治疗长岛型掌跖角化症的药物中的应用。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，郑雯，丘碧莹，杨斌，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：
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