【技术实现步骤摘要】
本申请涉及肿瘤防治领域。具体而言，涉及体外制备与扩增干性car-t细胞的方法。本申请还涉及一种用于体外制备与扩增干性car-t细胞的试剂盒，纤维蛋白原和凝血酶在制备所述试剂盒中的用途，以及通过本申请的方法或试剂盒所获得的干性car-t细胞。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞技术(chimeric antigen receptor-t cell，car-t)是一种新出现的过继性细胞疗法，该技术将患者t细胞在体外激活、修饰和增殖后回输到患者体内，通过t细胞表达的特异性受体，靶向性识别肿瘤细胞，并显示较强的杀伤活性。目前国内外已有多款car-t细胞疗法上市，用于治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等血液瘤。但在占比更大的实体瘤中，car-t细胞疗法效果却十分有限。主要是因为回输的car-t细胞都是基于终末分化的效应性t细胞来制备的，在体内难以长期存活，极大影响了过继性细胞治疗的临床效果。实体肿瘤微环境复杂，使得car-t细胞难以浸润到肿瘤内部。即使少量car-t细胞浸润到肿瘤内部，肿瘤内部的免疫抑制环境也会诱导car-t细胞进入耗竭状态，无法发挥抗肿瘤作用。
2、干性t细胞是一种罕见的记忆性t淋巴细胞亚群，具有干细胞样的自我更新能力及重建整个记忆性和效应性t细胞亚群的多能潜力。干性t细胞能够特异性识别多种病毒和自身肿瘤抗原，与其他已知的记忆性细胞相比，干性t细胞具有更高的增殖能力，能在体内长期维持，在抗原的刺激下能迅速产生大量细胞因子，发挥更强的抗肿瘤和抗炎症免疫功能。
3、鉴于干性t细胞强大的自我增殖能力和体内存活能力
技术实现思路
1、人纤维蛋白原(fibrinogen)是一种由肝细胞合成和分泌的糖蛋白。它是血浆中含量最高的凝血因子之一，能够在凝血酶的作用下转化为纤维蛋白，凝固后形成稳定的、多孔的纤维蛋白凝胶。作为一种不溶性蛋白，纤维蛋白(fibrin)可被分散酶(dispase)消化并降解。利用纤维蛋白凝胶培养系统可以为细胞提供一个3d的培养环境，更好地模拟体内环境，从而提供更接近生理状态的实验条件，这对于研究细胞行为、细胞与细胞之间的相互作用以及细胞与微环境之间的相互作用具有重要意义。
2、不限于具体理论，本申请的技术方案至少部分基于这样的发现：将前述3d培养系统应用于car-t细胞培养中，有助于更深入地了解细胞行为，开发出更有效的癌症治疗策略。
3、本申请通过使用纤维蛋白原和凝血酶建立3d纤维蛋白凝胶培养系统，在体外大量扩增干性t细胞的同时，完成干性t细胞的car组装。利用该方法制备的干性car-t细胞在体内外均表现出更强的增殖能力和杀伤能力，且肿瘤浸润的数量更多，存活时间更长。
4、为了解决体外无法大量制备和扩增干性car-t细胞的难题，特提出本申请。
5、在第一方面，本申请提供了一种体外制备与扩增干性car-t细胞的方法，其包括如下步骤或由以下步骤组成：
6、1)获得分离的cd8+t细胞；
7、2)激活所述cd8+t细胞；
8、3)将car基因引入激活的cd8+t细胞，获得引入car基因的cd8+t细胞；
9、4)将所述引入car基因的cd8+t细胞、纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液混合，并在适合细胞生长的条件下培养，获得干性car-t细胞培养物；
10、优选地，所述方法进一步包括：
11、5)使所述培养物与分散酶接触，获得干性car-t细胞。
12、在一些实施方案中，在本申请的方法的步骤1)中，所述cd8+t细胞分离自动物的外周血、脐带血、癌组织、胸水或腹水；优选地，所述动物是哺乳动物，所述哺乳动物是非人哺乳动物或人，更优选所述哺乳动物是人。
13、在一些实施方案中，在本申请的方法的步骤2)中，通过在适合细胞生长的条件下，用cd3单克隆抗体、cd28单克隆抗体和il-2孵育所述cd8+t细胞来激活所述cd8+t细胞。
14、在进一步的实施方案中，所述cd3单克隆抗体的终浓度为0.1-10μg/ml，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml，更优选1-5μg/ml，进一步优选2.5μg/ml。
15、在进一步的实施方案中，所述cd28单克隆抗体的终浓度为0.1-10μg/ml，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml，更优选0.1-2μg/ml，进一步优选1μg/ml。
16、在进一步的实施方案中，所述il-2的终浓度为10-1000iu/ml，例如但不限于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000iu/ml，更优选50-200iu/ml，进一步优选100iu/ml。
17、在进一步的实施方案中，用cd3单克隆抗体、cd28单克隆抗体和il-2孵育所述cd8+t细胞24-72小时，优选24-48小时，例如但不限于24、26、28、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、46、48小时，进一步优选36小时。
18、在一些实施方案中，在本申请的方法的步骤3)中，通过表达car的慢病毒将car基因引入激活的cd8+t细胞，所述表达car的慢病毒转染的moi＝0.5-10，例如但不限于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，优选moi＝1。
19、在进一步的实施方案中，在慢病毒转染时加入凝聚胺，其终浓度为10μg/ml。
20、在一些实施方案中，在本申请的方法的步骤4)中，将引入car基因的cd8+t细胞与纤维蛋白原溶液混合，接种到用凝血酶溶液预先孵育的培养板中，孵育30分钟后添加培养基，其中所述纤维蛋白原为人纤维蛋白原，所述凝血酶为人凝血酶。
21、在一些实施方案中，所述纤维蛋白原的终浓度为1-20mg/ml，例如但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/ml，更优选5-10mg/ml，进一步优选8mg/ml。
22、在一些实施方案中，所述凝血酶的浓度为0.01-1u/μl，例如但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体外制备与扩增干性CAR-T细胞的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
4.根据权利要求1所述的方法，其中：
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
7.一种试剂盒，其用于体外制备与扩增干性CAR-T细胞，并且包含：
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中：
9.纤维蛋白原和凝血酶在制备用于体外制备与扩增干性CAR-T细胞的试剂盒中的用途，其中：
10.通过权利要求1至6中任一项所述的方法或权利要求7或8所述的试剂盒所获得的干性CAR-T细胞，其具有以下特征中的一种或多种：
【技术特征摘要】
1.一种体外制备与扩增干性car-t细胞的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
4.根据权利要求1所述的方法，其中：
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
7.一种试剂盒，其用于...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄波，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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