【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，具体的涉及对同型半胱氨酸和叶酸代谢水平异常的基因检测。
技术介绍
1、亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)是叶酸代谢的关键酶，主要功能是将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸,5-甲基四氢叶酸是同型半胱氨酸再次甲基化为蛋氨酸的甲基供体。mtherc677t多态性即677cc型(野生型)、677ct型(杂合突变型)及677tt型(纯合突变型)。c677t位点的突变使酶对热不耐受而活性降低2，与cc型个体相比，ct型个体酶活性只有65％，而tt型个体酶活性仅有30％，同型半胱氨酸hcy再次甲基化受阻，从而使其不能甲基化为蛋氨酸而造成堆积，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症(hhcy)。大量流行病学和临床研究都证实高同型半胱氨酸是动脉粥样硬化、心肌梗死、脑卒中及外周血管病的独立危险因素。同时，慢性的细胞内同型半胱氨酸的升高可导致腺苷蛋氨酸与腺苷同型半胱氨酸的比值降低，使甲基转移酶受抑制出现低甲基化，可造成染色体不分离，与出生缺陷密切相关，如唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷。鉴于高同型半胱氨酸和叶酸代谢水平的异常对于医疗和诊断的重要作用，目前市场上已经有相关的基因检测试剂盒。但是目前的试剂盒在检测效果上存在不稳定、检测灵敏度差、检测活性低、成本高、工艺复杂等问题。如何提供一种用于同型半胱氨酸和叶酸代谢异常的灵敏度高、稳定性好、工艺控制严格有效的工艺成为研发的重点。
技术实现思路
1、鉴于在基因检测领域，尤其是对同型半胱氨酸和叶酸代谢水平异常的基因
2、为实现上述目的及其它相关目的，本专利技术公开用于同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒及其具体生产工艺。
3、(1)主要组成成分
4、
5、 序号 名称 来源 产品中的用途 1 mthfrc677t的突变型m质粒 上海生工 阳性对照 2 mthfrc677t的野生型wt质粒 上海生工 阳性对照 3 1*te 上海生工 空白对照
6、将mthfr c677t的突变型m质粒和mthfr c677t的野生型wt质粒用1*te分别稀释至4ng/μl，继续稀释具体配制方式参照下表：
7、
8、将上述混合液用1*te稀释100倍配制成阳性对照液。
9、(2)主要仪器
10、
11、(3)pcr生产工艺的确定及反应试剂配制分装
12、依据本公司已有的pcr基因检测产品的开发经验，以本次产品设计开发确定的主要原材料hotstart h i taq master m i x(含udg酶)热启动防污染型酶反应体系，设计三种生产工艺试剂盒(具体配方见下表)对比研究，筛选合适的生产工艺体系：
13、
14、
15、按照上述配方分别配制三种形式试剂盒，每种试剂盒配制500人份，每管分装20人份，除去损耗，大概共计20管。置于-20℃保存。并于10天，20天，30天，一月，两月，四月，六月，十二月跟踪对比试验结果。跟踪结果显示，从信号值稳定性灵敏度等方面看，生产工艺三优于生产工艺一，生产工艺一优于生产工艺二。因此选择第三种生产工艺作为最终的生产工艺。
16、具体生产工艺如下：
17、(1)扩增液的配制
18、物料准备：
19、
20、稀释与分装：
21、将引物探针干粉取出，在4000rpm以上高速离心30秒；向管中加入(管内总nmo l e数×0.1)ml的1×te缓冲液，即配制浓度为10μm的引物；盖好管盖，在旋涡混合器上震荡2分钟，使充分溶解后，4000rpm以上高速离心30秒；取一个无核酶塑料瓶，标记为混合液；用移液器取5xhotstart hi taq buffer(mg2+)，加入以上无核酶塑料瓶中。用移液器取稀释好的引物探针，加入以上无核酶塑料瓶中；用移液器取ddh2o，加入以上无核酶塑料瓶中；取棕色冻存管(可避光)，每管中加入以上步骤配制的混合液。贴标签待包装。于中间站冰箱-15℃以下保存。
22、(2)空白对照的分装
23、物料准备：
24、 辅料名称 1 1*te
25、分装：
26、取冻存管，管中加入1*te，作为空白对照。贴标签待包装。于中间站冰箱-15℃以下保存。
27、(3)酶反应液的配制与分装
28、物料准备：
29、 辅料名称 1 hotstarthitaqmasterpcrmix(25x)
30、配制与分装：
31、无需配制，直接分装。取冻存管，管中加入hotstart h i taq master pcr mi x(25x)。贴标签待包装。于中间站冰箱-15℃以下保存。
32、(4)阳性对照配制与分装
33、物料准备：
34、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒由以下部分组成，(1)扩增液、(2)酶反应液、(3)空白对照，(4)阳性对照；所述扩增液包括引物探针和buffer；所述酶反应液包括UNG酶，Taq酶；所述阳性对照采用含MTHFR C677T的突变型M质粒和野生型WT质粒。
2.一种如权利要求1所述的同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒的制备工艺，其特征在于，扩增液、酶反应液、空白对照，阳性对照分别通过配制、内分装、质量控制、外包组装，从而得到基因检测试剂盒。
4.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒，其特征在于，引物探针组合为0.2μM引物/0.2μM探针M/0.3μM探针WT组合时，SNP分型效果最好。即当引物及探针浓度为10μM时，上下游引物用量分别为0.4μL，M探针用量为0.4μL，WT探针用量为0.6μL，扩增效率较好。
5.根据权利
...【技术特征摘要】
1.一种具有同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒由以下部分组成，(1)扩增液、(2)酶反应液、(3)空白对照，(4)阳性对照；所述扩增液包括引物探针和buffer；所述酶反应液包括ung酶，taq酶；所述阳性对照采用含mthfr c677t的突变型m质粒和野生型wt质粒。
2.一种如权利要求1所述的同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸水平和叶酸代谢水平的基因检测试剂盒的制备工艺，其特征在于，扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：张秦鲁，惠文利，马乐，郭莉莉，
申请(专利权)人：西安金磁纳米生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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