【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物及发酵工程，具体涉及一种高产(r)-3-羟基丁酸的工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、(r)-3-羟基丁酸(r-3hb)是一种具有光学活性的手性化合物，是药物和精细化工生产中很有价值的中间体，在医药和化工生产领域具有广泛的应用。r-3hb可以直接作为药物，预防和治疗多种疾病，也可以作为前体，合成维生素、碳青霉烯类药物、大环内酯类化合物、信息素和芳香烃等化合物。此外，r-3hb可作为单体合成聚3-羟基丁酸(p3hb)。p3hb是一种应用前景广阔的生物降解塑料，具有类似聚丙烯的特性，但能够在多种环境条件下快速降解。目前，r-3hb的合成方法主要包括微生物发酵法和化学合成法。化学法合成手性化合物由于条件控制苛刻，不可避免地产生副产物，在经济上是不可行的。相比之下，利用生物法合成手性化合物具有较好的立体选择性和经济性，并且更加绿色安全，因此生物法已经成为合成r-3hb的首要选择。生物法合成r-3hb可主要分为胞内解聚phb和直接催化底物乙酰辅酶a生成r-3hb两种思路。通过直接催化底物生成r-3hb的生产速率明显快于通过降解phb的合成方法，因此直接催化合成r-3hb是更加简单经济的生产方式。近年来研究者针对r-3hb的直接生物合成路径进行许多探索，已经建立了tesb，buk和pct三种直接合成途径(appl microbiol bio
3、目前针对r-3hb的生物合成已有一些代谢调控的手段，但主要针对关键酶的过表达和副产物合成基因的敲除，缺乏系统性的代谢工程策略，也没有针对底盘细胞中心碳代谢途径的优化和改造的报道。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种高产(r)-3-羟基丁酸的工程菌及其构建方法和应用。具体的，本专利技术以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株，建立了从乙酰辅酶a出发合成r-3hb的生物合成路径，并通过合成途径优化、nadph合成优化和宿主细胞中心碳代谢调控等多个层面的代谢工程改造策略，提高了r-3hb的合成能力，达到了目前已知的r-3hb最高产量和效率。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
2、具体的，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一个方面，提供一种高产(r)-3-羟基丁酸的工程菌，所述工程菌通过在底盘菌中过表达r-3hb合成途径的关键酶β-酮基硫解酶突变体基因、乙酰乙酰辅酶a还原酶突变体基因、硫脂酶基因、nadph合成相关的膜结合转氢酶基因、nad激酶基因、乙酰辅酶a合成酶基因，并在底盘菌的基因组非编码小rna基因前插入t7-laco序列以及敲除底盘菌的乙醛酸循环抑制因子基因构建获得。
4、本专利技术的第二个方面，提供上述高产(r)-3-羟基丁酸的工程菌的构建方法，所述构建方法包括：
5、以大肠杆菌作为底盘菌，以大肠杆菌作为底盘菌，对所述底盘菌进行如下改造：
6、过表达r-3hb合成途径的关键酶β-酮基硫解酶突变体基因、乙酰乙酰辅酶a还原酶突变体基因、硫脂酶基因、nadph合成相关的膜结合转氢酶基因、nad激酶基因、乙酰辅酶a合成酶基因，并在底盘菌的基因组非编码小rna基因前插入t7-laco序列以及敲除底盘菌的乙醛酸循环抑制因子基因。
7、本专利技术的第三个方面，提供上述工程菌在生产(r)-3-羟基丁酸中的应用。
8、本专利技术的第四个方面，提供一种(r)-3-羟基丁酸的工业化生产方法，所述工业化生产方法包括：对上述工程菌进行发酵培养；以及分离纯化获取(r)-3-羟基丁酸。
9、本专利技术的第五个方面，提供上述工程菌或上述工业化生产方法在化工、可降解材料及医药工业领域中的应用。
10、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
11、上述技术方案公开了以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，通过对r-3hb生物合成途径、nadph的合成、宿主细胞的中心碳代谢途径进行了多层次的组合调控，经代谢工程技术建立了r-3hb的工程菌，首次通过系统代谢工程策略建立了工程大肠杆菌制备r-3hb的高效生物合成技术，解决了工程大肠杆菌制备r-3hb产量和合成效率低下的问题。为r-3hb的高效生物合成提供了新的技术方法。
12、现有技术中r-3hb报道的最高产量为16.3g/l，生产效率为1.02g/l/h。本专利技术构建的工程菌可以实现r-3hb的产量达到75.7g/l，产率为0.34g/g葡萄糖，生产效率为1.26g/l/h，本专利技术获得的r-3hb产量是现有技术报告的r-3hb最高产量的4.64倍，因此上述工程菌具有可观的实际应用价值和应用前景。
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1.一种高产(R)-3-羟基丁酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过在底盘菌中过表达R-3HB合成途径的关键酶β-酮基硫解酶突变体基因、乙酰乙酰辅酶A还原酶突变体基因、硫脂酶基因、NADPH合成相关的膜结合转氢酶基因、NAD激酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因，并在底盘菌的基因组非编码小RNA基因前插入T7-lacO序列以及敲除底盘菌的乙醛酸循环抑制因子基因构建获得。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述底盘菌为大肠杆菌，进一步为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述β-酮基硫解酶突变体基因，为来源于真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha的β-酮基硫解酶突变体基因phaA(F219Y)；所述乙酰乙酰辅酶A还原酶突变体基因，为来源于真氧产碱杆菌R.eutropha的乙酰乙酰辅酶A还原酶突变体基因phaB(Q47L)；所述硫脂酶基因，为来源于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)硫脂酶基因tesB；所述NADPH合成相关的膜结合转氢酶基因，为来源于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的膜结合
4.权利要求1-3任一项所述高产(R)-3-羟基丁酸的工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括：
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，利用引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3克隆获得硫脂酶基因tesB，利用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5克隆获得膜结合转氢酶基因pntAB，利用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7克隆获得NAD激酶基因yfjB，利用引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9克隆获得乙酰辅酶A合成酶基因acs；
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，利用自杀质粒pRE112介导的同源重组法在基因组非编码小RNA csrB基因前插入T7-lacO序列，以及，利用P1噬菌体转导法敲除基因组的乙醛酸循环抑制因子基因iclR。
8.权利要求1-3任一项所述工程菌在生产(R)-3-羟基丁酸中的应用。
9.一种(R)-3-羟基丁酸的工业化生产方法，其特征在于，所述工业化生产方法包括：对权利要求1-3任一项所述工程菌进行发酵培养；以及分离纯化获取(R)-3-羟基丁酸；
10.权利要求1-3任一项所述工程菌或权利要求9所述工业化生产方法在化工、可降解材料及医药工业领域中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高产(r)-3-羟基丁酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过在底盘菌中过表达r-3hb合成途径的关键酶β-酮基硫解酶突变体基因、乙酰乙酰辅酶a还原酶突变体基因、硫脂酶基因、nadph合成相关的膜结合转氢酶基因、nad激酶基因、乙酰辅酶a合成酶基因，并在底盘菌的基因组非编码小rna基因前插入t7-laco序列以及敲除底盘菌的乙醛酸循环抑制因子基因构建获得。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述底盘菌为大肠杆菌，进一步为大肠杆菌e.colibl21(de3)。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述β-酮基硫解酶突变体基因，为来源于真氧产碱杆菌ralstonia eutropha的β-酮基硫解酶突变体基因phaa(f219y)；所述乙酰乙酰辅酶a还原酶突变体基因，为来源于真氧产碱杆菌r.eutropha的乙酰乙酰辅酶a还原酶突变体基因phab(q47l)；所述硫脂酶基因，为来源于大肠杆菌e.coli bl21(de3)硫脂酶基因tesb；所述nadph合成相关的膜结合转氢酶基因，为来源于大肠杆菌e.coli bl21(de3)的膜结合转氢酶基因pntab；所述nad激酶基因，为来源于大肠杆菌e.coli bl21(de3)的nad激酶基因yfjb；所述乙酰辅酶a合成酶基因，为来源于大肠杆菌e.coli bl21(de3)的乙酰辅酶a合成酶基因acs；所述非编码小rna基因，为来源于大肠杆菌e.coli bl21(de3)的非编码小rna基因csrb；所述乙醛酸循环抑制因...
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