【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、反式-2-癸烯酸是一种中链脂肪酸，含有10个碳原子，在α和β碳位处有一个不饱和双键，其分子式为c10h18o2，其相对分子质量为170.25。
2、研究表明反式2-癸烯酸及其衍生物对治疗神经性疾病具有特殊的疗效，可作为神经类药物、香料、保健品等重要产品的中间体、其应用价值十分广泛。例如被用作合成蜂王浆的重要活性因子10-羟基-2-癸烯酸。10-羟基-2-癸烯酸具有重要的抑菌、抗癌和免疫调节等活性，而在自然环境中，10-羟基-2-癸烯酸仅存在于工蜂的上颌腺中，因此，反式2-癸烯酸的生物合成将为未来10-羟基-2-癸烯酸的生物合成途径奠定基础。除医药用途外，反式2-癸烯酸在材料方面也具有较大的用途，如可以使用2-癸烯酸作为铅配体来合成高质量的纳米棒材料。
3、目前反式2-癸烯酸的主要合成方法为化学法，然而化学合成法制备反式2-癸烯酸步骤复杂，副产物多，反应可控性低，环境污染严重，不适合工业化大规模生产。目前反式2-癸烯酸价格昂贵约为3万/kg。因此进一步研究反式2-癸烯酸高效且绿色的合成方式对于其应用价值的进一步开发探究具有重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌，所述基因工程菌包括脂
4、所述脂酰辅酶a氧化酶基因aco的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述脂酰辅酶a硫酯酶基因cpfatb1的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、根据本专利技术优选的，所述基因工程菌的宿主菌株为酿酒酵母；
6、进一步优选的，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株wt-2ko。wt-2ko菌株在专利(一种构建高产脂肪酸酿酒酵母工程菌的方法，cn113106109b)提及，为敲除了酿酒酵母烯酯酰coa水合酶以及硫解酶基因，阻断了脂肪酸β-氧化途径。
7、上述生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌的构建方法，包括步骤如下：
8、(1)构建质粒pet28a-aco，然后以质粒pet28a-aco为模板进行pcr扩增，得到aco基因片段；
9、(2)构建质粒pet28a-cpfatb1，然后以质粒pet28a-cpfatb1为模板进行pcr扩增，得到cpfatb1基因片段；
10、(3)将aco基因片段和和酶切后的载体pesc-ura进行无缝克隆，得到重组质粒pesc-ura-aco；再将cpfatb1基因片段和酶切后的重组质粒pesc-ura-aco进行无缝克隆，得到重组质粒pesc-ura-aco-cpfatb1；
11、(4)将重组质粒pesc-ura-aco-cpfatb1转化到酿酒酵母中，经筛选、鉴定后，得到生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌。
12、上述基因工程菌在生产反式-2-癸烯酸中的应用。
13、根据本专利技术优选的，所述应用是以癸酸为底物生产反式-2-癸烯酸，具体方法如下：
14、(1)将基因工程菌接入sd-ura尿嘧啶缺陷型种子培养基中，在28～32℃下振荡培养12～16h；然后以初始od600为0.3～0.5的接种量，将种子液接种至sg-ura尿嘧啶缺陷型发酵培养基中，在28～32℃下振荡诱导培养20～24h，离心，收集菌体；
15、(2)将步骤(1)收集的菌体用sg-ura尿嘧啶缺陷型发酵培养基重悬，然后向重悬后培养基中加入癸酸，在28～32℃下诱导培养20～24h，得到反式-2-癸烯酸。
16、根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述sd-ura尿嘧啶缺陷型种子培养基成分组成为：基础培养基ynb 6～7g/l、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1～1.5g/l、质量浓度为1.5～2.5％葡萄糖；
17、所述sg-ura尿嘧啶缺陷型发酵培养基：基础培养基ynb 6～7g/l、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1～1.5g/l、质量浓度为3.5～4.5％半乳糖。
18、根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述离心的条件为：3500～5000rpm下离心10～25min。
19、根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述癸酸在重悬后培养基中的终浓度为0.4～0.6g/l。
20、本专利技术的有益效果：
21、1、酿酒酵母本身是一种食品安全菌株，不产生内毒素，本专利技术首次将脂酰辅酶a氧化酶基因aco和脂酰辅酶a硫酯酶基因cpfatb1共同转入酿酒酵母中，构建了生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌，实现了在酿酒酵母中以癸酸为底物生产反式-2-癸烯酸。
22、2、本专利技术通过优化脂酰辅酶a氧化酶基因aco和脂酰辅酶a硫酯酶基因cpfatb1，以及优化转化过程中的相关条件，来提高工程菌株酿酒酵母生产反式-2-癸烯酸的产量。经过大量实验和筛选后得到基因工程菌wt-2ko-pesc-ura-aco-cpfatb1，其反式-2-癸烯酸产量达到了30.5mg/l，从而为反式-2-癸烯酸的工业化生产奠定基础。
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1.一种生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包括脂酰辅酶A氧化酶基因ACO和脂酰辅酶A硫酯酶基因CpFatB1；
2.如权利要求1所述的的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌株为酿酒酵母。
3.如权利要求2所述的的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株WT-2KO。
4.权利要求1所述的生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.权利要求1所述的基因工程菌在生产反式-2-癸烯酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是以癸酸为底物生产反式-2-癸烯酸，具体方法如下：
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述SD-Ura尿嘧啶缺陷型种子培养基成分组成为：基础培养基YNB 6～7g/L、尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物1～1.5g/L、质量浓度为1.5～2.5％葡萄糖；
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的条件为：3500～5000rpm下离心10～25min。>
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述癸酸在重悬后培养基中的终浓度为0.4～0.6g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包括脂酰辅酶a氧化酶基因aco和脂酰辅酶a硫酯酶基因cpfatb1；
2.如权利要求1所述的的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌株为酿酒酵母。
3.如权利要求2所述的的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株wt-2ko。
4.权利要求1所述的生产反式-2-癸烯酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：
5.权利要求1所述的基因工程菌在生产反式-2-癸烯酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，王兆云，宿春丽，张亦桑，上官思范，王瑞明，李丕武，汪俊卿，王婷，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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