【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断，具体为一种用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物及其应用。
技术介绍
1、随着免疫检查点阻断疗法的发展和临床应用，免疫治疗彻底改变了黑色素瘤、转移性尿路上皮癌、晚期非小细胞肺癌和结直肠癌等晚期癌症的治疗格局。靶向程序性死亡受体-1(pd-1)及其相关配体(pd-l1)、淋巴细胞活化基因3(lag3)和细胞毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)的检查点抑制剂作为单一疗法或联合疗法的单克隆抗体显著延长了黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期。然而，仍有相当比例的患者对免疫治疗表现出耐药性，无法从中获得临床益处。为了克服这种耐药性，正在评估其他免疫检查点抑制受体作为潜在的免疫治疗靶点。
2、b和t淋巴细胞衰减子(btla)基因位于3号染色体的长臂上，其编码的蛋白全长289个氨基酸，属于免疫球蛋白超家族，包括pd-1、ctla-4、cd28和诱导型t细胞共刺激分子(icos)。btla在蛋白结构和功能上与ctla-4和pd-1相似，包含胞外域、跨膜域和胞质域。在其胞质尾部区域有两个免疫受体酪氨酸抑制基序。疱疹病毒进入介导子(hvem)是btla的唯一配体。hvem的结合激活酪氨酸磷酸化并介导src同源2(sh2)域包含的磷酸酶1/2的募集，从而抑制b细胞和t细胞的增殖和活化。类似于ctla-4和pd-1，btla是一种由活化的t细胞和b细胞、树突状细胞(dcs)亚群、巨噬细胞和自然杀伤(nk)细胞表达的免疫检查点抑制受体，通过hvem-btla结合抑制抗肿瘤免疫反应。针对btla的单克隆抗体(tab
3、免疫治疗反应的机制已经被广泛研究。总体而言，黑色素瘤患者中高t细胞浸润、升高的程序性死亡配体(pd-l1)表达、高肿瘤突变负荷或干扰素γ(ifnγ)特征表达与免疫治疗反应较好相关。另一方面，jak突变、pten丧失、抗原呈递缺陷、wnt/β-连环蛋白过表达和psmb8启动子甲基化与免疫治疗耐药相关，但这些在黑色素瘤患者队列中发生频率较低。dna甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，直接控制基因转录。免疫检查点基因如ctla4、pdcd1、pd-l1、pd-l2、tigit和lag3的甲基化已被证明可以预测黑色素瘤的预后和免疫治疗反应。最新的研究结果显示，btla启动子的甲基化和黑色素瘤的预后和免疫治疗反应密切相关，可以作为黑色素瘤的预后标志物以及预测免疫治疗反应和免疫细胞浸润的标志物。因此,检测btla基因的甲基化状态,对黑色素瘤的治疗、预后判断等方面具有重要意义。
4、dna甲基化是基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。dna甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中,dna的甲基化仅发生于cpg的胞嘧啶上,在dna甲基化转移酶(dnmts)的作用下使cpg二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶(mc)。这种dna修饰方式并没有改变基因序列,但是它可以调控基因的表达。dna甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制,其在维持正常细胞功能染色质结构修饰、x染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
5、目前研究dna甲基化的方法主要有:1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐(bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。其中重亚硫酸盐修饰法是目前应用最为广泛的cpg甲基化检测方法。该方法采用na2s205,处理样本dna,将未发生甲基化的c转化为u,而发生甲基化的mc保持不变；经过pcr扩增后,u转变为t,而mc转变为c,从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为c/t(y)多态性,通过检测目标位点上的c/t状态,可以确定是否存在基因的甲基化。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物及其应用，解决了上述
技术介绍
中提出的问题。
2、本专利技术技术方案如下：
3、用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物，所述生物标志物为经过甲基化修饰的btla基因。
4、进一步，所述btla基因包括2个cpg位点，分别是cg24157392位点和cg03995631位点，所述cg24157392位点的核苷酸序列如序列表seq id no：2所示，所述的cg03995631位点的核苷酸序列如序列表seq id no：3所示。
5、如上述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，用于制备预测肿瘤预后和免疫治疗效果的制剂、试剂盒或药物。
6、进一步，所述试剂盒或药物用于检测肿瘤组织样本中btla mrna水平或btla基因序列上的2个cpg位点的甲基化水平。
7、进一步，所述试剂盒包括特异性针对btla基因的引物或探针，或者针对btla基因序列上的2个cpg位点的引物或探针。
8、进一步，所述试剂盒是作为实时定量pcr、基因芯片、免疫组化、组织芯片、高通量测序进行肿瘤预后预测和肿瘤免疫治疗有效性预测的药物。
9、进一步，所述药物是作为实时定量pcr、基因芯片、免疫组化、组织芯片、高通量测序进行肿瘤预后预测和肿瘤免疫治疗有效性预测的药物。
10、有益效果
11、相对于现有技术，本专利技术有以下有益效果：
12、本专利技术基于cg03995631、cg24157392和启动子的甲基化水平的生存分析表明，btla低甲基化患者总生存期显著延长。同时还进行了接收者操作特征(roc)分析的曲线下面积(auc)比较，以比较不同截止时间(1、2和3年)死亡预测的敏感性和特异性，发现5年生存期的auc分别为0.88(cg03995631)、0.94(cg24157392)和0.92(btla启动子)，btla启动子甲基化在预测黑色素瘤患者的总生存期方面表现更佳。
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1.用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为经过甲基化修饰的BTLA基因。
2.根据权利要求1所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物，其特征在于：所述BTLA基因包括2个CpG位点，分别是cg24157392位点和cg03995631位点，所述cg24157392位点的核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示，所述的cg03995631位点的核苷酸序列如序列表Seq ID No：3所示。
3.用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，包括权利要求1-2任一项所述的生物标志物，其特征在于：用于制备预测肿瘤预后和免疫治疗效果的制剂、试剂盒或药物。
4.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，其特征在于：所述试剂盒或药物用于检测肿瘤组织样本中BTLA mRNA水平或BTLA基因序列上的2个CpG位点的甲基化水平。
5.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，其特征在于：所述试剂盒包括特异性针对BTLA基因的引物或探针，或者针对
6.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，其特征在于：所述试剂盒是作为实时定量PCR、基因芯片、免疫组化、组织芯片、高通量测序进行肿瘤预后预测和肿瘤免疫治疗有效性预测的药物。
7.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，其特征在于：所述药物是作为实时定量PCR、基因芯片、免疫组化、组织芯片、高通量测序进行肿瘤预后预测和肿瘤免疫治疗有效性预测的药物。
...【技术特征摘要】
1.用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为经过甲基化修饰的btla基因。
2.根据权利要求1所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物，其特征在于：所述btla基因包括2个cpg位点，分别是cg24157392位点和cg03995631位点，所述cg24157392位点的核苷酸序列如序列表seq id no：2所示，所述的cg03995631位点的核苷酸序列如序列表seq id no：3所示。
3.用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，包括权利要求1-2任一项所述的生物标志物，其特征在于：用于制备预测肿瘤预后和免疫治疗效果的制剂、试剂盒或药物。
4.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤预后和免疫治疗效果的生物标志物的应用，其特征在于：所述试剂盒或药...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨明磊，夏培苡，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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