【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种生产β-胡萝卜素的基因工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
1、β-胡萝卜素是一种脂溶性的类胡萝卜素。在实际应用中，不仅可以作为着色剂，也是人体内合成维生素a的前体，具有抗氧化、增强免疫力等重要的功效，广泛应用于食品、医药和动物饲料等领域。目前主要的制备方法包括：1)化学合成：主要以β-紫罗兰酮为原料，经过一系列化学反应，生成β-胡萝卜素。但是存在副产物、多种异构体、活性低、不能被人体有效吸收等问题；2)植物提取：常用方法有溶剂萃取法、超临界萃取法等，但主要的问题在于产量低、成本高等；3)微生物合成：作为一种有效的合成手段，可以较好的解决上述部分问题。目前工业上主要的生产菌株包括杜氏盐藻、三孢布拉霉等，但是存在生长周期长等局限。近年来，逐渐开展了以大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等作为本底菌株，用于β-胡萝卜素的生产。
2、解脂耶氏酵母是一种非常规的产油酵母，也是一种公认安全(gras)的菌株，目前已用于多种高附加值化合物的合成，如脂类化合物和萜类化合物。虽然解脂耶氏酵母不具备β-胡萝卜素的内源合成途径，但是由于其富含乙酰coa以及高效的mva途径，结合胞内丰富的脂质，可以为脂溶性β-胡萝卜素的合成提供充足的前体(ggpp)和存储空间。同时，作为一种真核生物，解脂耶氏酵母体内的多种细胞器，可以作为多种代谢途径异源表达的场所，为促进β-胡萝卜素的合成提供更加有效的方法。因此，解脂耶氏酵母是一种生产β-胡萝卜素的优良菌株。
3、虽然已有较多的研究利用解脂耶氏酵母发酵生
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种提高外源基因同源重组效率，利于后续操作以及外源基因的基因组定向整合的，且同时能够提高β-胡萝卜素产量的基因工程菌株。利用crispr/cas9系统或定点整合的方式，敲除解脂耶氏酵母细胞内负责非同源重组(nhej)的关键基因ku70/ku80，引入酿酒酵母中负责同源重组(hr)的关键基因rad52，以提高解脂耶氏酵母自身的同源重组效率，促进外源基因的定点整合；同时，在解脂耶氏酵母基因组上定点整合异源的β-胡萝卜素合成基因，实现β-胡萝卜素的生物合成；最后对解脂耶氏酵母的代谢途径进行改造，主要涉及关键基因的过表达，以及利用一些酶突变体(erg20和carrp的突变体)，提高酶的催化效率，加强β-胡萝卜素的合成。
2、因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种生产β-胡萝卜素的基因工程菌，所述基因工程菌是将来源于酿酒酵母的rad52基因表达盒整合入敲除了ku70和ku80基因的解脂耶氏酵母菌株。
3、优选地，酿酒酵母的rad52基因表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的a08位点。
4、优选地，所述rad52基因序列是经过密码子优化所得，所述rad52基因具有seq idno.11所示的核苷酸序列，或其简并序列。
5、优选地，所述rad52基因表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌pylrad52启动子，终止子为解脂耶氏酵母菌的tylrad52终止子。
6、优选地，所述基因工程菌的基因组中整合了经密码子优化的异源基因carrp基因表达盒、carb基因表达盒和crte基因表达盒中的至少一种。
7、优选地，所述carrp和/或carb基因来源于卷枝毛霉菌(mucor circinelloides)；
8、优选地，所述carrp的基因具有如seq id no.8所示的核苷酸序列，或其简并序列；
9、优选地，所述carb的基因具有如seq id no.9所示的核苷酸序列，或其简并序列；
10、优选地，所述crte基因来源于红发夫酵母(phaffia rhodozyma)；
11、优选地，所述crte的基因具有如seq id no.10所示的核苷酸序列，或其简并序列。
12、优选地，所述异源基因的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的ku80位点。
13、优选地，所述基因工程菌株进一步插入idi基因和/或egr20基因的基因表达盒。
14、优选地，所述idi基因和/或egr20基因来源于解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)。
15、优选地，所述idi基因具有如seq id no.12所示的核苷酸序列，或其简并序列；
16、优选地，所述egr20基因具有如seq id no.13所示的核苷酸序列，或其简并序列。
17、优选地，所述idi基因和egr20基因的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的d17位点。
18、优选地，所述各基因的表达盒的启动子选自pexp、pfbain、pgpd和php4d中的任意一种；终止子选自txpr2、tmigl、tcyc1t和tlip2中的任意一种。
19、优选地，出发菌株为解脂耶氏酵母po1f。
20、本专利技术的第二个目的在于提供构建上述任一项所述的基因工程菌的方法，所述方法包括将rad52基因表达盒以线性化片段的形式整合入敲除ku70和ku80基因的解脂耶氏酵母基因组。
21、优选地，所述方法进一步包括将carrp基因表达盒、carb基因表达盒、crte基因表达盒、idi基因表达盒和egr20基因表达盒以线性化片段的形式整合入所述解脂耶氏酵母基因组。
22、本专利技术的第三个目的在于提供上述任一项所述的基因工程菌或上述任一项所述的方法制备得到的基因工程菌在生产β-胡萝卜素中的应用。
23、本专利技术的第四个目的在于提供一种生产β-胡萝卜素的方法，所述方法包括：
24、(1)将上述任一项所述的基因工程菌或上述任一项所述的方法制备得到的基因工程菌经发酵培养，到发酵产物；
25、(2)有机溶液萃取所述发酵产物，收集β-胡萝卜素。
26、专利技术的效果
27、本专利技术选用解脂耶氏酵母野生型菌株po1f作为底盘菌株，敲除了解脂耶氏酵母po1f的内源基因ku70和ku80，引入酿酒酵母来源的rad52基因，提高外源基因同源重组效率，利于后续操作以及外源基因的基因组定向整合。同时，本专利技术在ku80位点表达了卷枝毛霉菌来源的优化的carrp和carb基因，在d17位点过表达内源基因优化的erg20和idi。在有效的位点成功表达了具有较高催化效率的相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产β-胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将来源于酿酒酵母的RAD52基因表达盒整合入敲除了KU70和KU80基因的解脂耶氏酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，酿酒酵母的RAD52基因表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的A08位点；
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述RAD52基因表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌PylRAD52启动子，终止子为解脂耶氏酵母菌的TylRAD52终止子。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中整合了异源基因CarRP基因表达盒、CarB基因表达盒和CrtE基因表达盒中的至少一种；
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌株进一步插入IDI基因和/或EGR20基因的基因表达盒；
6.根据权利要求4或5所述的基因工程菌，其特征在于，所述异源基因的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的KU80位点；
7.一种构建权利要求1～6中任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将CarRP基因表达盒、CarB基因表达盒、CrtE基因表达盒、IDI基因表达盒和EGR20基因表达盒以线性化片段的形式整合入所述解脂耶氏酵母基因组。
9.一种根据权利要求1～6中任一项所述的基因工程菌或权利要求7～8中任一项所述的方法制备得到的基因工程菌在生产β-胡萝卜素中的应用。
10.一种生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种生产β-胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将来源于酿酒酵母的rad52基因表达盒整合入敲除了ku70和ku80基因的解脂耶氏酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，酿酒酵母的rad52基因表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母菌株的a08位点；
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述rad52基因表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌pylrad52启动子，终止子为解脂耶氏酵母菌的tylrad52终止子。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的基因组中整合了异源基因carrp基因表达盒、carb基因表达盒和crte基因表达盒中的至少一种；
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌株进一步插入idi基因和/或egr20基因的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，郭施琪，崔小慧，胡鑫峰，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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