【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种三基因报告细胞系及其构建方法和用途。
技术介绍
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)主要由三个功能域构成，分别是胞外结合结构域(extracellular binding domain)、跨膜结构域(transmembranedomain)和胞内结构域(intracellular domain)。胞外结合结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段及一段起连接作用的铰链区(hinge region)构成。跨膜结构域负责将car分子的细胞外结构域与细胞内结构域连接起来，从而将配体识别信号转导至细胞内。胞内结构域由共刺激结构域(co-stimulatory domain)和信号转导结构域(signaling domain)构成，其中共刺激域通常来自cd28受体家族(例如cd28和icos)或肿瘤坏死因子受体家族(例如4-1bb、ox40和cd27)，信号转导结构域通常为t细胞受体tcr/cd3ζ链，其含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunor tyrosine-based activation motifs，itam)。所述共刺激结构域和信号转导结构域对于改善基于car的抗肿瘤功能至关重要。
2、由于car分子的结构涉及到多个组分，使得car优化和改造过程难以测试，因此必须进行系统的评估和考量。目前，对car构建体的评估是凭经验进行，通常是直接在原代t细胞上制备car-t，然后通过一系列体外和体内实验选出最佳的候选car。但是这种方法耗费大
3、当前有研究在jurkat t细胞上分别基于nfat、nf-κb、ap-1三种转录因子信号通路设计的荧光报告细胞系[2,4]，应用于car分子筛选。这三种转录因子在t细胞激活过程中起重要作用。其中，在nf-κb信号通路中，nf-κb通过经典和非经典途径调节t细胞功能，在经典nf-κb通路中，rela(p65)与p50组成的异二聚体被激活后，转运入细胞核内，在细胞核内单独或联合其它转录因子，包括ap-1、ets和stat，并共同诱导靶标基因表达；在非经典nf-κb通路中，nf-κb2(p52)/relb组成的异二聚体复合体，转运入细胞核内，诱导靶标基因表达，以促进细胞的生存、增殖和细胞因子的产生。在nfat信号通路中，nfat1-4受ca2+钙调神经磷酸酶(calcineurin，can)信号通路调节，在tcr(t cell receptor，t细胞受体)信号传导或细胞因子受体信号传导时的nfat激活导致易位到细胞核，在细胞核内nfat与fos、jun等其它转录因子协同，启动靶基因的转录。tcr触发的刺激激活ap-1，通过调节tcr信号促进细胞的分化、存活和增殖。
4、另有研究构建nur77-gfp jurkat报告细胞系并将其应用于car的筛选。nur77是一种细胞核孤生受体转录因子蛋白，其在多种细胞的信号转导和凋亡的调节中具有十分重要的作用[3,5]。在人t细胞内nur77特异性反应tcr信号传导，且不受细胞因子和toll样受体介导的信号影响，因此nur77可作为tcr信号传导的报告基因[1]。该研究将gfp基因定点插入到nur77基因终止子前，与其共用一个启动子，因此nur77和gfp会同时表达，通过监控gfp信号强弱来间接反映tcr的激活情况。同理，因car也能激活tcr信号通路，所以将car表达在该报告细胞系上，通过绿色荧光蛋白(gfp)荧光信号的变化可以反映car的激活情况，以此筛选出所需的car构建体。
5、目前该基于nur77基因开发的报告细胞系只能反应出car信号转导结构域中tcr/cd3ζ链的激活强度，也就是第一信号强度；但是共刺激结构域，即第二信号的激活情况却无法评价。但第二信号的激活强度对细胞内信号活化、t细胞持续增殖、释放细胞因子和抗肿瘤能力起到关键作用。如传统4-1bb结构共刺激域主要通过非经典nf-κb信号通路，起到共刺激作用，延长car-t细胞存活[6]；而cd28结构共刺激域多通过经典nf-κb信号通路、nfat信号通路和ap-1信号通路等调节细胞的分化、存活和增殖。
6、参考文献：
7、[1]cn112899236a.
8、[2]chimeric antigen receptor library screening using a novel nf-κb/nfat reporter cell platform，molecular therapy，2019,27(2):287-299.
9、[3]wo2019089982a1.
10、[4]“assessment of costimulation and coinhibition in a tripleparameter t cell reporter line:simultaneous measurement of nf-κb,nfat and ap-1”,journal of immunological methods,430,10-20.
11、[5]“endogenous nur77 is a specific indicator of antigen receptorsignaling in human t and b cells”，the journal of immunology 198.2(2017):657-668.
12、[6]“4-1bb costimulation promotes car t cell survival throughnoncanonical nf-κb signaling”，science signaling 13.625(2020):eaay8248。
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、针对现有技术中的nur77 jurkat报告细胞，只能监控car结构中第一信号的激活情况，无法反应协同刺激的第二信号这一缺陷。本专利技术提供了一种可同时评价发挥信号转导的第一信号和负责协同刺激的第二信号，能更加准确的反映出car的功能的nur77/nf-κb/nfat jurkat三基因报告细胞系。
3、用于解决问题的方案
4、本专利技术人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过将mcherry基因定点插入到nur77基因终止子前，与其共用一个启动子，因此nur77和mcherry会同时表达，通过监控mcherry信号强弱来间接反映本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三基因报告细胞系，其特征在于，所述三基因报告细胞系包括：Nur77/NF-κBJurkat报告细胞系和Nur77/NFAT Jurkat报告细胞系。
2.根据权利要求1所述的三基因报告细胞系，其中，
3.根据权利要求2所述的三基因报告细胞系，其中，所述NF-κB-RE-BFP基因的序列如SEQ ID NO：19所示，或者为与SEQ ID NO：19所示的序列具有80％或更高的同一性的核苷酸序列；
4.根据权利要求1～3任一项所述的三基因报告细胞系，其中所述Nur77/NF-κB Jurkat报告细胞系的保藏编号为：CGMCC No.45454；
5.权利要求1～4任一项所述的三基因报告细胞系在嵌合抗原受体(CAR)分子筛选和/或功能评价中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述CAR分子对应的靶点选自以下组成的组中的任一种：CLEC12A、BCMA、CLDN18.2、Mesothelin、NKG2DL、MUC1、MUC16、GPRC5D、NY-ESO-1、MAGE-A3、Her2、B7-H3、PSMA、P
7.一种特异性靶向Nur77的sgRNA，所述sgRNA的序列选自由以下项组成的组中的任一种：
8.一种特异性靶向Nur77的donor DNA载体，所述donor DNA载体的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述donor DNA载体的右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述donor DNA载体中的P2A-mcherry基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
9.一种宿主细胞，其包含如权利要求8所述的特异性靶向Nur77的donor DNA载体。
10.一种组合物，其包含权利要求7所述的特异性靶向Nur77的sgRNA、Cas9蛋白和权利要求8所述的特异性靶向Nur77的donor DNA载体。
11.如权利要求10所述的组合物在构建权利要求1～4任一项所述三基因报告细胞系中的用途。
12.一种构建三基因报告细胞细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种三基因报告细胞系，其特征在于，所述三基因报告细胞系包括：nur77/nf-κbjurkat报告细胞系和nur77/nfat jurkat报告细胞系。
2.根据权利要求1所述的三基因报告细胞系，其中，
3.根据权利要求2所述的三基因报告细胞系，其中，所述nf-κb-re-bfp基因的序列如seq id no：19所示，或者为与seq id no：19所示的序列具有80％或更高的同一性的核苷酸序列；
4.根据权利要求1～3任一项所述的三基因报告细胞系，其中所述nur77/nf-κb jurkat报告细胞系的保藏编号为：cgmcc no.45454；
5.权利要求1～4任一项所述的三基因报告细胞系在嵌合抗原受体(car)分子筛选和/或功能评价中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述car分子对应的靶点选自以下组成的组中的任一种：clec12a、bcma、cldn18.2、mesothelin、nkg2dl、muc1、muc16、gprc5d、ny-eso-1、mage-a3、her2、b7-h3、psma、psca、psa、prame、globo h、afp、folr1、ror1、cea、gpc3、egfr、epcam、dll3、gd2、wt1、cblb、...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳男，危华锋，田纪元，刘懿锋，
申请(专利权)人：信达细胞制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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