本发明专利技术公开了一种间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析方法。所述方法是通过TGF‑β诱导肺部支气管上皮细胞BEAS‑2B发生上皮间质转化，体外构建得到肺纤维化细胞模型，然后在此基础上给予间充质干细胞进行干预治疗，最后分别从mRNA水平、细胞表面表达蛋白水平和因子分泌水平三方面探究间充质干细胞抑制BEAS‑2B细胞间质情况，实现间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析。本发明专利技术提供的间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析方法可稳定指示间充质干细胞治疗肺纤维化的效果，在间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析中具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析方法。
技术介绍
1、肺纤维化是由急性肺损伤、哮喘、慢性阻塞性肺炎、肺癌等多种急慢性肺部疾病衍生而来的病理改变，其病理改变是以成纤维细胞异常增殖和细胞外基质大量沉积并伴有弥漫性炎症、肺组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变。特发性肺纤维化为其最常见的肺纤维化类型，患者经确诊后平均生存期只有3-5年，且目前尚无治愈药物。
2、对肺纤维化形成机制研究发现，肺纤维化形成的重要过程包括内质网应激、机体氧化还原水平失衡、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，emt)、内皮间质转化和成纤维细胞活化为肌成纤维细胞等。肺上皮细胞发生的上皮间质转化是肺纤维的重要发病机制之一，来源于emt的成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌胞外基质导致肺纤维化的进展，在肺纤维化的生理过程中发挥着关键作用。因此，逆转和抑制emt的进程可能是治疗肺纤维化的主要途径。
3、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)，具有向炎症或损伤部位归巢的特点，可以抑制炎症反应，促进组织修复与再生和免疫调节作用等优势，经静脉注射后首先归巢于肺部，对肺部疾病有很好的治疗作用。但目前关于mscs治疗肺纤维化的药效学研究，主要存在于动物实验等体内药效研究，对于体外药效研究鲜有报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种间充质干细胞治疗肺纤维化的体外药效分析方法。
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p>2、为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种间充质干细胞治疗纤维化的体外药效分析方法。3、本专利技术提供的间充质干细胞治疗纤维化的体外药效分析方法包括如下步骤：
4、1)将含有间充质干细胞培养体系的嵌套培养小室插入含有纤维化细胞培养体系的细胞培养板中，使所述纤维化细胞与所述间充质干细胞进行非接触式共培养，得到共培养后的纤维化细胞；所述纤维化细胞为诱导上皮细胞发生上皮间质转化后得到的细胞；所述间充质干细胞培养体系和所述纤维化细胞培养体系中的培养基均为支气管上皮细胞生长基础培养基；
5、2)从蛋白水平和/或mrna水平和/或因子分泌水平检测所述共培养后的纤维化细胞，评价所述间充质干细胞对纤维化的治疗效果；
6、所述蛋白水平包括上皮细胞钙粘素cd324的蛋白表达水平；
7、所述mrna水平包括纤连蛋白fibronectin的mrna表达水平和emt转录因子snail的mrna表达水平；
8、所述因子分泌水平包括基质金属蛋白酶1的分泌水平和基质金属蛋白酶抑制因子1的分泌水平。
9、上述方法中，所述上皮细胞包括不同组织或器官来源的上皮细胞。
10、所述组织或器官包括但不限于肺、肝、肾、子宫、呼吸道、肺泡，对应的，所述上皮细胞包括但不限于肺上皮细胞、肝上皮细胞、肾上皮细胞、子宫内膜上皮细胞、呼吸道上皮细胞、肺泡上皮细胞。
11、在本专利技术的具体实施方案中，所述上皮细胞为肺上皮细胞；所述肺上皮细胞包括但不限于肺部支气管上皮细胞beas-2b、气道上皮细胞hbe、肺上皮细胞a549。
12、上述方法中，所述纤维化细胞包括但不限于肺纤维化细胞、肝纤维化细胞、肾纤维化细胞、宫腔黏连、呼吸道纤维化细胞、肺泡纤维化细胞。
13、在本专利技术的具体实施方案中，所述纤维化细胞为肺纤维化细胞。
14、上述方法中，所述间充质干细胞包括人源间充质干细胞。
15、所述人源间充质干细胞包括但不限于人骨髓源间充质干细胞、人脐带源间充质干细胞、人脐带血源间充质干细胞、人脂肪源间充质干细胞。
16、在本专利技术的具体实施方案中，所述间充质干细胞为人脐带源间充质干细胞。
17、上述方法中，所述支气管上皮细胞生长基础培养基(即下文实施例中的bebm培养基)不含血清且包含用于支气管上皮细胞生长的必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子和微量矿物质。
18、在本专利技术的具体实施方案中，所述支气管上皮细胞生长基础培养基为lonza公司的产品，货号为cc-3171。
19、上述方法中，所述上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比可为1：(1-3)。
20、在本专利技术的具体实施方案中，所述肺上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比为1：1。
21、上述方法中，所述共培养的条件可为5％ co2，饱和湿度，37℃共培养24-72h。
22、在本专利技术的具体实施方案中，所述共培养的条件为5％ co2，饱和湿度，37℃共培养48h。
23、上述方法具体可包括如下步骤：
24、m1)将上皮细胞在细胞培养板中培养，诱导所述上皮细胞发生上皮间质转化，得到含有纤维化细胞培养体系的细胞培养板；所述细胞培养板中含有添加tgf-β的支气管上皮细胞生长基础培养基；
25、m2)将所述含有纤维化细胞培养体系的细胞培养板中的培养基(添加tgf-β的支气管上皮细胞生长基础培养基)更换为支气管上皮细胞生长基础培养基，然后将含有间充质干细胞培养体系(由间充质干细胞和支气管上皮细胞生长基础培养基组成)的嵌套培养小室插入所述细胞培养板中，使所述纤维化细胞与所述间充质干细胞进行非接触式共培养，得到共培养后的纤维化细胞；
26、m3)检测所述共培养后的纤维化细胞的上皮细胞钙粘素cd324的蛋白表达水平、纤连蛋白fibronectin的mrna表达水平、emt转录因子snail的mrna表达水平、基质金属蛋白酶1的因子分泌水平和基质金属蛋白酶抑制因子1的因子分泌水平，评价所述间充质干细胞对纤维化的治疗效果。
27、上述m1)中，所述培养的条件可为5％ co2，饱和湿度，37℃培养2-24h，具体的，所述培养的条件为5％ co2，饱和湿度，37℃培养2h。
28、上述m1)中，所述tgf-β在所述支气管上皮细胞生长基础培养基中的浓度可为5-20μg/ml；具体的，所述tgf-β在所述支气管上皮细胞生长基础培养基中的浓度为10ng/ml。
29、上述m1)中，所述上皮细胞在诱导发生上皮间质转化之前采用begm培养基进行培养。
30、上述m2)中，所述间充质干细胞在进行非接触式共培养之前采用友康完全培养基进行培养。
31、上述m3)中，采用流式细胞术检测所述共培养后的纤维化细胞的上皮细胞钙粘素cd324的蛋白表达水平。
32、上述m3)中，采用荧光定量pcr技术检测所述共培养后的纤维化细胞的纤连蛋白fibronectin和emt转录因子snail的mrna表达水平。
33、上述m3)中，采用elisa技术检测所述共培养后的纤维化细胞培养上清中的基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶抑制因子1的因子分泌水平。
34、上述m3)中，可按照如下方法评价所述间充质干细胞对纤维化的治疗效果：若本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种间充质干细胞治疗纤维化的体外药效分析方法，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞为不同组织或器官来源的上皮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞为肺上皮细胞；
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述支气管上皮细胞生长基础培养基不含血清。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人脐带源间充质干细胞。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比为1：(1-3)。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述共培养的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃共培养24-72h。
8.一种试剂盒，其包括支气管上皮细胞生长基础培养基、用于检测上皮细胞钙粘素CD324蛋白表达水平的物质、用于检测纤连蛋白Fibronectin mRNA表达水平的物质、用于检测EMT转录因子Snail mRNA表达水平的物质、用于检测基质金属蛋白酶1含量的物质和用于检测基质金属蛋白酶抑制因子1含量的物质；
9.如下N1)-N10)任一种应用：
10.根据权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物为间充质干细胞；
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【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞治疗纤维化的体外药效分析方法，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞为不同组织或器官来源的上皮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞为肺上皮细胞；
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述支气管上皮细胞生长基础培养基不含血清。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人脐带源间充质干细胞。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比为1：(1-3)。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，潘锦华，齐奇，张金龙，闫芹芹，石晓宇，
申请(专利权)人：武汉光谷中源药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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