【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鸭呼肠孤病毒活疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
1、2015年以来，山东、江苏、河北等樱桃谷鸭饲养密集区的许多鸭群发生了以脾脏出血、白色坏死灶或大理石样硬化病变的疾病，病鸭可见肺、心肌、肾、腺胃和肠粘膜等组织出血等病变。种鸭可见跗关节肿大，内有黄色或血样渗出物，严重者关节腔内有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度跛行，给养鸭业造成严重经济损失。2017年，我公司从发病樱桃谷种鸭群中成功分离出病原，鉴定为鸭呼肠孤病毒，命名为鸭呼肠孤强毒株17117株。该病毒与现已报道流行的鸡源呼肠孤病毒、番鸭源呼肠孤病毒进行遗传进化分析，属于不同分支，为一种新型鸭呼肠孤病毒。
2、免疫接种是防治该病的最有效手段。将该毒株(鸭呼肠孤强毒株17117株)经vero细胞上连续传代致弱120代，筛选出高度适应vero细胞、安全性良好、且具有良好免疫保护效果的弱毒株(命名为鸭呼肠孤病毒q株)，可用于作为生产毒株制备鸭呼肠孤病毒病活疫苗。上述两毒株(鸭呼肠孤强毒株17117株和鸭呼肠孤病毒q株)已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：cgmccno.18889和cgmccno.18890。
3、在工艺研究阶段，我们发现，无论是贴壁培养还是微载体培养，反复冻融、低温保存以及成品制备时冷冻干燥均造成病毒效价大幅下降。而在细胞毒疫苗生产过程中，半成品通常需要经过-15℃冻融使病毒释放、冻藏周转1～3周，然后经过
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒活疫苗的制备方法：通过提供一种冻存保护剂用于鸭呼肠孤病毒活疫苗半成品的冻存，解决目前出现的鸭呼肠孤病毒在反复冻融、低温保存过程中出现的效价损失大的问题，保证活疫苗半成品有效活性；通过提供一种冻干保护剂用于鸭呼肠孤病毒活疫苗的冷冻干燥，保证疫苗的冻干损失，方便储存和运输等。
2、本专利技术的目的是保证高羽份数疫苗制备，以便疫苗上市后能满足规模化养殖场的需求。
3、本专利技术的目的可以通过如下技术方案实现。
4、本专利技术中半成品冻存保护剂，按质量百分比计，包括以下组分：5～10％蔗糖、15～25％海藻糖、0.5～2％右旋糖酐40、1～3％甘油、0.5～2％bsa、甘氨酸1～3％，余量为专用溶剂，以上总和为100％。
5、本专利技术中半成品冻干保护剂，按质量百分比计，包括以下组分：10～15％蔗糖、3～5％明胶、1～2％ pvpk30、1～3％酶解酪蛋白，余量为专用溶剂，以上总和为100％。
6、上述冻存保护剂和冻干保护剂专用溶剂为20～100mmol/l的磷酸盐缓冲液，ph应为7.0～7.4，特别是由k2hpo4和kh2po4组成的缓冲液。
7、生物制品活疫苗制备主要包括病毒增殖和冷冻干燥两个过程，主要有三种效应会导致活性成分的变性：①低温效应；②冻结效应；③脱水效应。在半成品冻存和冷冻干燥两个阶段都会出现低温效应和冻结效应。
8、病毒等微生物能在低温下长期保存，说明低温本身并不会对活性造成大的损失，但是却极容易在降温和复温过程中受溶液冻结、融化以及溶液渗透压变化等因素的作用损害，从而导致效价下降。
9、冻结效应主要是由于冻结过程中不断结晶导致的溶液浓度快速升高，引起相关理化性质变化(如离子浓度增加、溶液中各组分选择性结晶、ph值改变等)，而这些变化就可能引起生物制品中活性组分变质。
10、脱水效应是指冻干过程中，一部分结合水在干燥过程中被除去，富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷的平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用，从而使蛋白质发生凝集，最终导致蛋白质变性。
11、在生物制品冻结、解冻和冷冻干燥中，常使用多糖作为保护剂。海藻糖是由两分子葡萄糖通过半缩醛羟基结合而成的一种非还原性双糖，性质非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，从而维持生命体的生命过程和生物特征。是常见的天然低温冻存保护剂之一；蔗糖可以通过改变蛋白质中结合水的状态，与蛋白质分子结合，抑制蛋白质的冷冻变性以提高稳定性；和糖一样，多元醇甘油的官能团也是羟基，可以以任意比例与水混合，因此，在生物制品的冻存、冷冻干燥过程中同样能起到保护作用。
12、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)与酶解酪蛋白都是相对分子质量较高的大分子，右旋糖酐溶液冻结后由于粘度高，水分子运动受到限制，不能吸附到晶核或结晶长大的活性位置，因而抑制了冰晶长大，提高了冷冻稳定性，也常作为低温保护剂；聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)与酶解酪蛋白对生物制品的低温保存和冷冻干燥都是很好的保护剂，在生物制品的脱水过程中又是很好的赋形剂，作为支撑骨架对生物制品起到很好的支撑作用。
13、本专利技术所述的鸭呼肠孤活疫苗的制备方法包括如下步骤：
14、半成品的制备将该毒株经vero细胞上连续传代致弱120代，筛选出高度适应vero细胞、安全性良好、具有良好免疫保护效果的弱毒株(命名为鸭呼肠孤病毒q株)，作为生产毒株制备鸭呼肠孤病毒病疫苗半成品(抗原)。
15、冻存保护剂和冻干保护剂的制备配制20～100mmol/l的磷酸盐缓冲液作为专用溶剂，优选k2hpo4和kh2po4组成的缓冲液；
16、按照质量配比称取蔗糖、海藻糖、右旋糖酐40、甘油、bsa、甘氨酸溶于专用溶剂中，0.22μm过滤除菌后作为冻存保护剂备用，鸭呼肠孤半成品和冻存保护剂按照8～5:1体积比混合均匀冻存；
17、按照质量配比称取蔗糖、明胶、pvpk30、酶解酪蛋白溶于专用溶剂中，115℃高压灭菌35分钟后作为冻干保护剂备用，冻干保护剂与半成品(含冻存保护剂)按照3～1:1体积比混合均匀，分装后进行冷冻干燥；
18、疫苗冻干冻干机开机，设定板层温度5℃，将分装好的混合液装入冻干机箱体内，维持30min；在1h内缓慢降温至-5℃，在此温度下维持30min；在1～2h内快速降温至-45℃，在此温度下维持2～3h，开始抽真空，在45min内将真空度控制在15～20pa；在2～3h内升温至-10℃，在此温度下维持6～8h；在1～2h内升温至5℃，在此温度下维持2～3h；在1～2h内升温至14℃，在此温度下维持2～3h；在1～2h内升温至28℃，在此温度下维持2～3h；抽极限真空2～3h，压力升测试通过后冻干结束。整个冻干过程约为26～32h。
19、本专利技术的优点在于：
20、(1)本专利技术的冻存保护剂应用于鸭呼肠孤半成品的保存环节，可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒活疫苗，其特征在于该活疫苗是由鸭呼肠孤病毒致弱Q株病毒制成；所述致弱鸭呼肠孤病毒是鸭呼肠孤强毒株17117株经Vero细胞上连续传代致弱120代，筛选出高度适应Vero细胞、安全性良好、且具有良好免疫保护效果的弱毒株命名为鸭呼肠孤病毒Q株，鸭呼肠孤强毒株17117株和鸭呼肠孤病毒Q株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCCNo.18889和CGMCCNo.18890。
2.如权利要求1所述鸭呼肠孤病毒弱毒活疫苗其特征在于疫苗的制备方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的专用溶剂，为按照质量配制20～100mmol/L的磷酸盐缓冲液优选K2HPO4和KH2PO4组成的缓冲液。
【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒活疫苗，其特征在于该活疫苗是由鸭呼肠孤病毒致弱q株病毒制成；所述致弱鸭呼肠孤病毒是鸭呼肠孤强毒株17117株经vero细胞上连续传代致弱120代，筛选出高度适应vero细胞、安全性良好、且具有良好免疫保护效果的弱毒株命名为鸭呼肠孤病毒q株，鸭呼肠孤强毒株17117株和鸭呼肠孤病毒q株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红娟，彭建云，贾爱琴，宋晓飞，郭大伟，王景伟，张连秀，丁雅苓，王保运，蔡利剑，郑兰广，王蕾，吴连勇，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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