【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶的基因工程，具体涉及一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶突变体及其应用。
技术介绍
1、菊糖是一种存在于许多植物和一些微生物中的果聚糖，其用途广泛，其不仅具有多种活性功能，可作为益生元使用，还具有稳定性、增稠性、泡沫形成能力和凝胶形成能力，使其能够在食品工业中广泛用作稳定剂、脂肪替代品、质地改良剂和感官增强剂。此外，在生物医药领域，菊粉还被用作赋形剂、冷冻保护剂和治疗剂的载体。
2、目前，商业化的菊糖主要从植物中提取，尤其是菊苣根，其菊粉含量高达15％至20％。近年来，使用菊粉蔗糖酶以蔗糖为底物，酶法生产微生物菊糖受到广泛关注。与植物提取相比，菊糖的生物合成能够避免植物的复杂分离和纯化过程，且相较于植物提取的菊糖而言，生物合成菊糖是以蔗糖为底物，在菊糖蔗糖酶的作用下，合成菊糖，采用该方法合成的菊糖通常具有更高的分子量。而多项研究表明，生物合成获得的高分子量菊糖相比于植物来源的低分子量菊糖表现出更优越的稳定性、凝胶形成能力和更高的乳化指数。因此，菊糖的生物合成为满足高分子量菊糖的生产需求并扩展其应用潜力提供了一个有前景的方法。
3、而目前，已鉴定的不同微生物来源的菊糖蔗糖酶，其大多存在酶活较低，热稳定性较差的缺陷，从而影响了高分子量菊糖生物合成的工业化进程。因此，通过分子改造的方式提高lactobacillus mulieris umb7800菊糖蔗糖酶的酶活和热稳定性对采用生物合成方法生产高分子量菊糖的具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技
2、为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案如下：
3、一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、作为进一步的技术方案，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶是由氨基酸序列如seq idno:3所示的菊糖蔗糖酶经过以下五个位点替换获得，所述五个位点替换分别为：250位的丙氨酸ala替换成缬氨酸val，344位的丝氨酸ser替换成天冬氨酸asp，434位的组氨酸替换成脯氨酸，526位的谷氨酸替换成天冬氨酸，531位的甘氨酸替换成脯氨酸。
5、作为进一步的技术方案，所述氨基酸序列如seq id no:3所示的菊糖蔗糖酶来源于lactobacillus mulieris umb7800。
6、一种编码所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的基因。
7、一种携带所述基因的突变质粒或细胞。
8、一种表达所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的工程菌株，是将所述的突变质粒导入到宿主中所得。
9、作为进一步的技术方案，所述宿主采用大肠杆菌bl21(de3)。
10、一种所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的制备方法，包括如下步骤：
11、(1)在pet-22b(+)-lamu-is的菊糖蔗糖酶序列和模拟结构的基础上确定突变位点，并构建重组质粒pet-22b(+)-lamu-is；
12、(2)以重组质粒pet-22b(+)-lamu-is为模板，设计正向突变引物和反向突变引物，对pet-22b(+)-lamu-is的菊糖蔗糖酶进行五轮定点突变，实现五个位点的替换，得突变体质粒；
13、(3)将构建成功的突变体质粒导入表达宿主e.coli bl21(de3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；
14、(4)离心菌体，重悬后超声破碎，纯化得到菊糖蔗糖酶的突变体酶。
15、所述的菊糖蔗糖酶的突变体酶在制备高分子量菊糖中的应用。
16、作为进一步的技术方案，所述高分子量菊糖的分子量为3.5×106g/mol。
17、作为进一步的技术方案，以蔗糖为底物，在菊糖蔗糖酶的作用下，发生酶促反应，生成菊糖；其中，所述酶促反应的温度为55℃，酶促反应体系的ph为6.0。
18、作为进一步的技术方案，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的比酶活为473u/mg；55℃下的半衰期为11.75h。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
20、本专利技术将来源于lactobacillus mulieris umb7800的菊糖蔗糖酶(也即野生型酶)的第250位的丙氨酸ala替换成缬氨酸val，344位的丝氨酸ser替换成天冬氨酸asp，434位的组氨酸替换成脯氨酸，526位的谷氨酸替换成天冬氨酸，531位的甘氨酸替换成脯氨酸后获得菊糖蔗糖酶的突变体酶，其相较于野生型酶而言，最适催化条件没有发生改变，但是酶催化蔗糖合成菊糖过程中的相对酶活提升了66％，55℃下半衰期约提高了4倍，极大地提高了酶的稳定性，更适用于酶法合成高分子量菊糖的工业化生产。
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1.一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶是由氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的菊糖蔗糖酶经过以下五个位点替换获得，所述五个位点替换分别为：250位的丙氨酸Ala替换成缬氨酸Val，344位的丝氨酸Ser替换成天冬氨酸Asp，434位的组氨酸替换成脯氨酸，526位的谷氨酸替换成天冬氨酸，531位的甘氨酸替换成脯氨酸。
3.根据权利要求2所述的一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的菊糖蔗糖酶来源于Lactobacillus mulierisUMB7800。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的基因。
5.一种携带如权利要求4所述基因的突变质粒或细胞。
6.一种表达权利要求1-3任一项所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的工程菌株，其特征在于，是将权利要求
7.根据权利要求6所述的工程菌株，所述宿主采用大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种如权利要求1-3所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求1-3任一项所述的菊糖蔗糖酶的突变体酶在制备菊糖中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，以蔗糖为底物，在菊糖蔗糖酶的作用下，发生酶促反应，生成菊糖；其中，所述酶促反应的温度为55℃，酶促反应体系的pH为6.0。
...【技术特征摘要】
1.一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述菊糖蔗糖酶的突变体酶是由氨基酸序列如seq id no:3所示的菊糖蔗糖酶经过以下五个位点替换获得，所述五个位点替换分别为：250位的丙氨酸ala替换成缬氨酸val，344位的丝氨酸ser替换成天冬氨酸asp，434位的组氨酸替换成脯氨酸，526位的谷氨酸替换成天冬氨酸，531位的甘氨酸替换成脯氨酸。
3.根据权利要求2所述的一种酶活和热稳定性提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，其特征在于，所述氨基酸序列如seq id no:3所示的菊糖蔗糖酶来源于lactobacillus mulierisumb78...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪大伟，沐万孟，杨俊雅，张书琦，张文立，徐炜，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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