【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种重组类人弹性蛋白及其规模化制备工艺。
技术介绍
1、弹性蛋白是结缔组织中常见的细胞外基质蛋白，主要为动脉、韧带、肺和皮肤等组织提供弹性。1992年，urry实验室开始以弹性蛋白的氨基酸序列组成为参考，通过基因工程技术重组制成由五肽重复单元(val-pro-gly-xaa-gly，vpgxg)串联组成的类人弹性蛋白(elp)，其中x是除了pro以外的任意一种氨基酸。由于与天然弹性蛋白结构相似，具有良好的生物相容性，低免疫原性。此外，elp最典型的特征是温度敏感性，即具有一个相转变温度(transition temperature，tt)。当外界温度低于相转变温度时，高度可溶，多肽链保持无序结构，处于溶解状态；当外界温度高于相转变温度时，蛋白自动聚集，多肽链由无序变为有序并从溶液中析出，形成沉淀。且其相转变过程往往是一个可逆过程。通过改变elp蛋白氨基酸组成、肽链长度、五肽重复单元的排列顺序以及溶液的离子强度、ph、蛋白浓度等条件，设计elp蛋白特定的相变温度，可应用于蛋白纯化过程中。
2、基于上述特性，elp蛋白已广泛用于：(1)组织器官的再生和形成，例如骨骼、眼、表皮的再生，以及类器官培养；(2)药物治疗，通过将抗癌药与类人弹性蛋白结合降低其毒性，提高病灶器官的药物浓度，或者延长药物半衰期，实现缓释作用；(3)elp融合技术可以用于蛋白质纯化中，类人弹性蛋白与目的蛋白融合后保留了类人弹性蛋白的相变特性，从而通过改变温度便可纯化目的蛋白。
3、目前elp蛋白主要通过大
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种重组类人弹性蛋白及其规模化制备工艺。
2、本专利技术的技术解决方案如下：
3、一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，取构建好的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵诱导重组help表达，管式离心收集发酵菌体后高压均质细胞破碎，絮凝沉降细胞碎片，硫酸铵沉淀目标蛋白后采用中空纤维膜处理，再通过离子交换层析精纯及超滤浓缩置换，获得液相纯度大于99％的蛋白原液，即得目标蛋白。
4、作为本专利技术的优选方案，包括以下步骤：
5、s1、高密度发酵：将构建好的表达重组help蛋白的大肠杆菌工程菌株进行两级种子培养活化，生长od600为10-20的二级种子液按2-10％接种量接种至发酵罐培养，提高搅拌转速、通气量，维持菌体良好生长，在od600＝15-20的对数生长初期降低培养温度至20-30℃，加入诱导剂，继续培养10-20h后停止发酵，得到发酵液；
6、s2、菌体收集：将发酵液高速离心10-15min洗涤菌体，收集菌体；
7、s3、高压均质破碎细胞：按1:10-1:3的质量比加入pbs溶液重悬步骤s2中的菌体，得到混悬液，将混悬液进行均质破碎2-3次，得到破碎液；
8、s4、絮凝离心：向破碎液中加入终体积浓度为0.1-0.5％的絮凝剂，絮凝1-2h后，离心收集上清液；
9、s5、中空纤维膜处理：向上清液中加入硫酸铵，于30℃孵育1-3h，用中空纤维膜过滤富集沉淀，再用3-5倍体积的0.1-0.5m硫酸铵洗涤沉淀，后用2-8℃预冷的复溶液溶解沉淀，收集复溶膜透过液；
10、s6、离子交换层析精纯：将复溶膜透过液过阴离子交换层析填料纯化，载样量为50-200mg/ml，收集流穿液和淋洗液；
11、s7、超滤浓缩置换：将流穿液和淋洗液的混合液用超滤膜包进行超滤浓缩置换，即得目标蛋白。
12、作为本专利技术的优选方案，步骤s1中，高密度发酵条件为加入诱导剂前的培养温度为37℃、溶氧控制在20-50％，搅拌转速为100-500rpm，通气量为0.5-2.5vvm，补料速度为4-8l/h，诱导剂为iptg，其浓度为0.2-1mm。
13、作为本专利技术的优选方案，步骤s2中，高速离心采用管式离心，在管式离心过程中通过冷却水控制温度15-25℃，管式离心速度大于15000rpm。
14、作为本专利技术的优选方案，步骤s3中，所述均质破碎条件为高压破碎2-3次，第一次5000-10000psi、第二或第三次10000-15000psi，低温冷却循环水控制温度为5-10℃。
15、作为本专利技术的优选方案，步骤s4中，絮凝剂为聚乙烯亚胺或二甲基二烯丙基氯化铵，离心采用管式离心，其进料速度为1.0-1.5l/min，离心速度为5000-10000rpm。
16、作为本专利技术的优选方案，步骤s5中，硫酸铵浓度范围为0.1-0.5m；
17、中空纤维膜的截留分子量为200-1000kd，单位面积中空纤维膜能够处理0.3-0.8kg/m2蛋白样品，剪切速率为2000-6000s-1。
18、作为本专利技术的优选方案，步骤s6中，阴离子交换填料为q ff，平均粒径为90μm，层析过程控制线性流速为120cm-160cm/h，纯化过程包括平衡、上样、淋洗和再生。
19、作为本专利技术的优选方案，步骤s7中，超滤膜包的截留分子量为5-10kd，其面积为0.46-1.38m2，进料压力为0.5-1.2bar，出料压力为0.3-1.0bar，跨膜压为0.5-1.5bar，通量为15-30lmh，浓缩3-5倍，洗滤3-5倍，最终获得的蛋白原液浓度为10-20mg/ml；
20、浓缩置换用的缓冲液为pbs缓冲液。
21、本专利技术还公开了一种如上任一所述的制备工艺制得的重组类人弹性蛋白，其氨基酸序列为(vpgvg)n，n＝40-60。
22、本专利技术的有益效果是：
23、(1)本专利技术的一种重组类人弹性蛋白的规模化制备工艺，构建的高效表达help工程菌发酵周期短，单批次时间不超过24h，发酵目标蛋白表达量高，可达5g/l以上；
24、(2)本专利技术的一种重组类人弹性蛋白的规模化制备工艺，整个纯化工艺过程简便高效，制备的蛋白纯度高，经过一步盐析、中空纤维膜处理和一步层析方法纯化，获得的help蛋白液相纯度达到99.9％，纯化收率超过80％；
25、(3)本专利技术的一种重组类人弹性蛋白的规模化制备工艺，整体制备工艺过程高效、成本低、废水少，适用于工业放大。
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1.一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，取构建好的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵诱导重组hELP表达，管式离心收集发酵菌体后高压均质细胞破碎，絮凝沉降细胞碎片，硫酸铵沉淀目标蛋白后采用中空纤维膜处理，再通过离子交换层析精纯及超滤浓缩置换，获得液相纯度大于99％的蛋白原液，即得目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S1中，高密度发酵条件为加入诱导剂前的培养温度为37℃、溶氧控制在20-50％，搅拌转速为100-500rpm，通气量为0.5-2.5vvm，补料速度为4-8L/h，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，其浓度为0.2-1mM。
4.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S2中，高速离心采用管式离心，在管式离心过程中通过冷却水控制温度15-25℃，管式离心速度大于15000rpm。
5.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其
6.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S4中，絮凝剂为聚乙烯亚胺或二甲基二烯丙基氯化铵，离心采用管式离心，其进料速度为1.0-1.5L/min，离心速度为5000-10000rpm。
7.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S5中，硫酸铵浓度范围为0.1-0.5M；
8.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S6中，阴离子交换填料为Q FF，平均粒径为90μm，层析过程控制线性流速为120cm-160cm/h，纯化过程包括平衡、上样、淋洗和再生。
9.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤S7中，超滤膜包的截留分子量为5-10kD，其面积为0.46-1.38m2，进料压力为0.5-1.2bar，出料压力为0.3-1.0bar，跨膜压为0.5-1.5bar，通量为15-30LMH，浓缩3-5倍，洗滤3-5倍，最终获得的蛋白原液浓度为10-20mg/ml；
10.一种如权利要求1-9任一所述的制备工艺制得的重组类人弹性蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为(VPGVG)n，n＝40-60。
...【技术特征摘要】
1.一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，取构建好的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵诱导重组help表达，管式离心收集发酵菌体后高压均质细胞破碎，絮凝沉降细胞碎片，硫酸铵沉淀目标蛋白后采用中空纤维膜处理，再通过离子交换层析精纯及超滤浓缩置换，获得液相纯度大于99％的蛋白原液，即得目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤s1中，高密度发酵条件为加入诱导剂前的培养温度为37℃、溶氧控制在20-50％，搅拌转速为100-500rpm，通气量为0.5-2.5vvm，补料速度为4-8l/h，诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，其浓度为0.2-1mm。
4.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤s2中，高速离心采用管式离心，在管式离心过程中通过冷却水控制温度15-25℃，管式离心速度大于15000rpm。
5.根据权利要求2所述的一种重组类人弹性蛋白规模化制备工艺，其特征在于，步骤s3中，所述均质破碎条件为高压破碎2-3次，第一次5000-10000psi、第二或第三次10000-15000psi，低...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，熊建伟，于伟，周路平，戴隆华，
申请(专利权)人：赣江中药创新中心，
类型：发明
国别省市：
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