【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质化学修饰，具体地，涉及分子探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、泛素是一个含有76个氨基酸的小蛋白，其序列在不同物种间高度保守。在三种酶(e1，e2，e3)的协同催化作用下，泛素与底物蛋白发生共价修饰，即泛素c端羧基与底物蛋白赖氨酸的侧链氨基形成异肽键，从而生成蛋白质泛素化。泛素自身也可以作为泛素化修饰的底物，利用序列中的七个赖氨酸(k6,k11,k27,k29,k33,k48,和k63)和n末端氨基(m1)，形成不同长度和连接方式的多聚泛素化修饰。另外，除了均一多聚泛素化修饰，近来还发现了非均一和分叉多聚泛素化修饰。不同类型的泛素链参与调控不同的生物过程，如k48多聚泛素链主要作为蛋白质降解信号，而k63多聚泛素链参与信号传递等非蛋白质降解过程。建立泛素化修饰模式与底物蛋白命运之间的关系将有助于泛素化修饰信号解析。然而，蛋白质泛素化修饰种类繁多，尤其是多聚泛素化，为泛素化修饰信号解析带来了巨大挑战。
2、泛素化修饰信号的识别和检测依赖于相关分子工具的开发。利用噬菌体文库筛选技术，人们相续开发了特异性识别8种连接方式泛素链的抗体，并广泛应用于免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学和蛋白质印迹等，实现了对不同连接方式泛素链的快速、简单检测，为破译泛素化修饰信号发挥了重要作用。然而，泛素抗体对泛素链的识别通过非共价相互作用，富集泛素化修饰蛋白时不能耐受强洗脱条件，难以去除非特异性结合蛋白。另外，泛素抗体相对高昂的价格也一定程度上限制了其使用，并且泛素抗体难以跨过细胞膜，没有催化活性，限制了内源性泛素信号的
3、生物正交方法一般包含两步操作：通过基因工程在蛋白质特定位点引入含有生物正交反应标签的非天然氨基酸或蛋白/多肽标签；通过生物正交蛋白标记将荧光分子、生物素以及蛋白质翻译后修饰等化学修饰标记到蛋白质中。然而，这些策略往往需要涉及基因改造，难以实现对天然蛋白质的化学修饰。
4、蛋白质化学修饰为新型生物制药的开发和研究蛋白质生物学功能的研究提供了有力的工具，具有广泛的生物学应用，如抗体药物偶联物的制备、蛋白质-蛋白质相互作用的检测和蛋白质翻译后修饰功能机制的阐明等。与传统的有机化学反应不同，在不破坏蛋白质内在结构和功能的情况下对蛋白质进行共价修饰需要考虑多种因素，包括生物相容性反应条件、低反应浓度和缺乏保护基团，以及需克服复杂的多组分的生物环境对目标蛋白进行选择性修饰。生物正交反应恰恰可以克服这些困难，通过高选择性化学反应，能够实现对特定蛋白定点、化学选择性共价标记，被广泛地运用于蛋白质化学修饰。
5、相比于生物正交方法，配体导向化学不需要涉及基因改造，可以实现对内源蛋白质的选择性化学修饰，包括细胞表面膜蛋白、细胞内蛋白的化学修饰。配体导向化学一般包含三个模块：导向配体、可切割的化学反应官能团和功能分子。通过配体-靶蛋白之间的邻近效应，诱导靶蛋白上的氨基酸与可切割的化学反应基团之间化学反应，配体导向试剂能够实现将探针共价标记靶蛋白。配体与受体之间的亲和力驱动的化学反应，实现对靶标蛋白的化学选择性化学标记。配体与靶蛋白之间亲和力和特异性识别，很大程度上决定了配体导向化学修饰的特异性和效率。
技术实现思路
1、1.专利技术要解决的技术问题
2、现有技术中泛素抗体对泛素链的识别通过非共价相互作用，富集泛素化修饰蛋白时不能耐受强洗脱条件，难以去除非特异性结合蛋白，以及泛素抗体难以跨过细胞膜，没有催化活性，限制了内源性泛素信号人工干预的技术问题。
3、2.技术方案
4、为达到上述目的，提供的技术方案为：
5、本专利技术的分子探针，所述分子探针为通式(ⅰ)所示化合物、立体异构体或互变异构体；
6、
7、r1为肽；r2为官能团；r3为功能性分子。
8、进一步地，所述通式(ⅰ)中r1为环肽ub4x，所述环肽ub4x具有seq id no:1所示的序列。
9、进一步地，所述通式(ⅰ)中r2为腈乙基或2,4-二硝基苯基；r3为生物素、香豆素、荧光素或双吖丙啶基团。
10、分子探针的制备方法，包括如下步骤：
11、利用固相多肽合成法，得到式(a)所示线性多肽；
12、将式(a)所示线性多肽通过分子内环化，得到式(b)所示环肽；
13、将式(b)所示环肽转化为多肽硫酯，之后与炔丙基氨接触，得到式(c)所示环肽化合物；
14、将式(c)所示环肽化合物与式(d)所示化合物进行环加成反应，得到所述分子探针；
15、
16、优选的，所述固相合成法为fmoc-固相多肽合成方法；2-cl-trt-nhnh2树脂作为fmoc-固相多肽合成的载体
17、进一步地，ph为10的碱性缓冲液中，式(a)所示线性多肽转为式(b)所示环肽。
18、进一步地，在-10℃条件下，ph为3的酸性缓冲液中，式(b)所示环肽与亚硝酸钠接触，然后与4-巯基苯乙酸接触，式(b)所示环肽转化为多肽硫酯；所述多肽硫酯与炔丙基氨接触，ph调至9～10，所述多肽硫酯转化为式(c)所示环肽化合物。
19、进一步地，式(b)所示环肽与亚硝酸钠的摩尔比为1∶7；式(b)所示环肽与4-巯基苯乙酸的摩尔比为1∶1～1∶50。
20、进一步地，中性缓冲液中，式(c)所示环肽化合物和式(d)所示化合物与cu2+接触，得到所述分子探针。
21、进一步地，式(c)所示环肽化合物和式(d)所示化合物的摩尔比为1∶1～1∶5。
22、分子探针的应用，将所述的分子探针应用于k48泛素链的选择性共价标记。
23、3.有益效果
24、采用本专利技术提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
25、本专利技术的分子探针，利用n-烷基-n磺酸酰胺作为反应linker，环肽分子探针可以将生物素、荧光分子以及光交联试剂二吖吡啶等功能性分子共价标记到泛素链上(如k48)。对不同连接类型的泛素链具有很好的化学选择性，可以区分泛素链的不同连接类型。
26、本专利技术的分子探针的制备方法，采用模块拼接的方法，通过构建含有不同功能基团的点击化学反应原件，拼接得到含有生物素、香豆素、荧光素或双吖丙啶等功能基团的分子工具，相较于抗体，环肽分子探针具有合成简单、易于保存等优点。
27、本专利技术分子探针的应用，另外，通过调换配体和探针的位置，可以实现将环肽共价转移至泛素链上，构建特异性靶向泛素链的共价抑制剂，拓展了蛋白质泛素化修饰信号解析。
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1.分子探针，其特征在于：所述分子探针为通式(Ⅰ)所示化合物、立体异构体或互变异构体；
2.根据权利要求1所述的分子探针，其特征在于：所述通式(Ⅰ)中R1为环肽Ub4x，所述环肽Ub4x具有SEQ ID NO:1所示的序列。
3.根据权利要求2所述的分子探针，其特征在于：所述通式(Ⅰ)中R2为腈乙基或2,4-二硝基苯基；R3为生物素、香豆素、荧光素或双吖丙啶基团。
4.分子探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述分子探针的制备方法，其特征在于：ppH为10的碱性缓冲液中，式(a)所示线性多肽转为式(b)所示环肽。
6.根据权利要求4所述分子探针的制备方法，其特征在于：在-10℃条件下，pH为3的酸性缓冲液中，式(b)所示环肽与亚硝酸钠接触，然后与4-巯基苯乙酸接触，式(b)所示环肽转化为多肽硫酯；所述多肽硫酯与炔丙基氨接触，pH调至9～10，所述多肽硫酯转化为式(c)所示环肽化合物。
7.根据权利要求6所述分子探针的制备方法，其特征在于：式(b)所示环肽与亚硝酸钠的摩尔比为1∶7；式
8.根据权利要求4所述分子探针的制备方法，其特征在于：中性缓冲液中，式(c)所示环肽化合物和式(d)所示化合物与Cu2+接触，得到所述分子探针。
9.根据权利要求8所述分子探针的制备方法，其特征在于：式(c)所示环肽化合物和式(d)所示化合物的摩尔比为1∶1～1∶5。
10.分子探针的应用，其特征在于：将权利要求1-3任一项所述的分子探针应用于K48泛素链的选择性共价标记。
...【技术特征摘要】
1.分子探针，其特征在于：所述分子探针为通式(ⅰ)所示化合物、立体异构体或互变异构体；
2.根据权利要求1所述的分子探针，其特征在于：所述通式(ⅰ)中r1为环肽ub4x，所述环肽ub4x具有seq id no:1所示的序列。
3.根据权利要求2所述的分子探针，其特征在于：所述通式(ⅰ)中r2为腈乙基或2,4-二硝基苯基；r3为生物素、香豆素、荧光素或双吖丙啶基团。
4.分子探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述分子探针的制备方法，其特征在于：pph为10的碱性缓冲液中，式(a)所示线性多肽转为式(b)所示环肽。
6.根据权利要求4所述分子探针的制备方法，其特征在于：在-10℃条件下，ph为3的酸性缓冲液中，式(b)所示环肽与亚硝酸钠接触，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王淼，郑勇，沈星艺，严程俊，梁军，
申请(专利权)人：合肥科生景肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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