【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，尤其涉及南亚果实蝇内参基因及其筛选和应用。
技术介绍
1、南亚果实蝇(zeugodacus tau)又名南瓜实蝇、南亚寡鬃实蝇，隶属双翅目(diptera)实蝇科(tephritidae)镞果实蝇属(zeugodacus)，在热带、亚热带和温带地区已成为果蔬作物上的一种重要害虫，其食性广泛，可为害16个科80余种植物，主要嗜食植物集中在甜瓜属、南瓜属、丝瓜属、冬瓜属和苦瓜属等蔬菜作物，一般损失达15％-30％，高时可达50％以上，严重影响瓜类蔬菜的产量和质量。
2、实时荧光定量pcr在生物信息学研究领域被广泛应用，其主要是用于测定基因表达相关情况，表现出便捷和准确相关的优势，获得广泛应用。通过这种方法测定时，设置高度保守、稳定表达的内参基因，进行对比分析可判断出目标基因的相对表达。内参基因在设置时应该确保在各种条件下的表达都稳定，不过根据实际的研究分析，符合这种要求的基因一般不存在。在物种发育时期、细胞类型等因素变化情况下，其表达也会产生一定改变。在各种研究条件下，稳定表达的内参基因的表达也会产生改变。因此，在不同的实验条件下，内参基因的评价对于精准定量具有重要意义。目前关于南亚果实蝇中内参基因稳定性的研究较少，这制约了果实蝇分子上的进一步研究，因此，在南亚果实蝇中挖掘高度可信的内参基因十分必要。
3、综上，本专利技术提供一种南亚果实蝇内参基因及其筛选和应用。
技术实现思路
1、针对以上不足，本专利技术提供一种南亚果实蝇内参基因及其
2、南亚果实蝇内参基因，所述内参基因为α-tubulin和g6phd；所述内参基因α-tubulin的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述内参基因g6phd的核苷酸序列如seq idno.2所示。
3、进一步地，所述内参基因的筛选方法包括以下步骤：
4、(1)根据南亚果实蝇多样本转录组库数据分析，选择10个南亚果实蝇基因作为候选内参基因；所述候选内参基因分别是：α-tubulin、g6phd、rab-1、rt、rps13、β-tubulin、dph1、hsp90、gaphd、和cp；
5、(2)根据所述候选内参基因的核苷酸序列设计荧光定量引物；
6、(3)提取南亚果实蝇总rna，以总rna为模板合成cdna；以所述cdna为模版，采用所述荧光定量引物进行qpcr扩增，获得荧光定量pcr数据；荧光定量pcr数据是ct值、稳定值sv值和相关系数r值。
7、(4)采用delta ct、normfinder、bestkeeper软件对所述荧光定量pcr数据进行稳定性评估分析，使用reffinder软件综合这些分析方法的结果推荐出在不同条件下表达最稳定的内参基因。
8、进一步地，步骤(1)中，所述候选内参基因α-tubulin的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述候选内参基因g6phd的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述候选内参基因rab-1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述候选内参基因rt的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述候选内参基因rps13的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述候选内参基因β-tubulin的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述候选内参基因dph1的核苷酸序列如seq idno.7所示；所述候选内参基因hsp90的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述候选内参基因gaphd的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述候选内参基因cp的核苷酸序列如seq idno.10所示。
9、进一步地，步骤(2)中，所述荧光定量引物的核苷酸序列为：
10、所述候选内参基因α-tubulin荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.11所示；反向序列如seq id no.12所示；
11、所述候选内参基因g6phd荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.13所示；反向序列如seq id no.14所示；
12、所述候选内参基因rab-1荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.15所示；反向序列如seq id no.16所示；
13、所述候选内参基因rt荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq id no.17所示；反向序列如seq id no.18所示；
14、所述候选内参基因rps13荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.19所示；反向序列如seq id no.20所示；
15、所述候选内参基因β-tubulin荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.21所示；反向序列如seq id no.22所示；
16、所述候选内参基因dph1荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq id no.23所示；反向序列如seq id no.24所示；
17、所述候选内参基因hsp90荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.25所示；反向序列如seq id no.26所示；
18、所述候选内参基因gaphd荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq idno.27所示；反向序列如seq id no.28所示；
19、所述候选内参基因cp荧光定量引物的核苷酸序列为：正向序列如seq id no.29所示；反向序列如seq id no.30所示。
20、进一步地，步骤(3)中，所述qpcr扩增体系为：master mix20μl，引物各0.4μl，模板cdna2μl，双蒸水进行补足。
21、进一步地，步骤(3)中，所述qpcr扩增程序为：预变性95℃30s；变性95℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；荧光信号收集于延伸阶段；qpcr反应结束后,立即进行溶解曲线的分析，溶解曲线条件如下：95℃15s，60℃60s，95℃15s(此过程进行荧光采集)。
22、进一步地，步骤(4)中，所述的稳定性评估分析为：采用delta ct，通过对所述候选内参基因的δct值的标准偏差进行两两比较，对基因表达的稳定性进行排序，评价所述候选内参基因的稳定性；采用normfinder软件，通过比较样本的组内变异和组间变异，计算基因的稳定值，并根据所述稳定值对基因进行排序来评估所述候选内参基因的稳定性；采用bestkeeper软件，基于相关系数变量来评价所述候选内参基因的稳定性；采用reffinder综合分析上述软件的分析结果，推荐出在不同条件下表达最稳定的内参基因，推荐的内参基因为α-tubulin和g6phd。
23、本专利技术南亚果实蝇内参基因可用于南亚果实蝇的基因表达分析。
24、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
25、本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.南亚果实蝇内参基因，其特征在于，所述内参基因为α-tubulin和G6PHD；所述内参基因α-tubulin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述内参基因G6PHD的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，所述内参基因的筛选方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(1)中，所述候选内参基因α-tubulin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述候选内参基因G6PHD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述候选内参基因Rab-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述候选内参基因RT的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述候选内参基因RPS13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述候选内参基因β-tubulin的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述候选内参基因DPH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述候选内参基因HSP90的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述候选内参基因GAPHD的核苷酸序
4.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光定量引物的核苷酸序列为：
5.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(3)中，所述qPCR扩增体系为：Master Mix20μL，引物各0.4μL，模板cDNA2μL，双蒸水进行补足。
6.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(3)中，所述qPCR扩增程序为：预变性95℃30s；变性95℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；荧光信号收集于延伸阶段；qPCR反应结束后，立即进行溶解曲线的分析，溶解曲线条件如下：95℃15s，60℃60s，95℃15s。
7.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(4)中，所述的稳定性评估分析为：采用Delta CT，通过对所述候选内参基因的ΔCt值的标准偏差进行两两比较，对基因表达的稳定性进行排序，评价所述候选内参基因的稳定性；采用NormFinder软件，通过比较样本的组内变异和组间变异，计算基因的稳定值，并根据所述稳定值对基因进行排序来评估所述候选内参基因的稳定性；采用Bestkeeper软件，基于相关系数变量来评价所述候选内参基因的稳定性；采用RefFinder综合分析上述软件的分析结果，推荐出在不同条件下表达最稳定的内参基因，推荐的内参基因为α-tubulin和G6PHD。
8.如权利要求1所述的南亚果实蝇内参基因在南亚果实蝇基因表达分析中的应用。
...【技术特征摘要】
1.南亚果实蝇内参基因，其特征在于，所述内参基因为α-tubulin和g6phd；所述内参基因α-tubulin的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述内参基因g6phd的核苷酸序列如seqid no.2所示。
2.根据权利要求1所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，所述内参基因的筛选方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(1)中，所述候选内参基因α-tubulin的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述候选内参基因g6phd的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述候选内参基因rab-1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述候选内参基因rt的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述候选内参基因rps13的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述候选内参基因β-tubulin的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述候选内参基因dph1的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述候选内参基因hsp90的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述候选内参基因gaphd的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述候选内参基因cp的核苷酸序列如seq id no.10所示。
4.根据权利要求2所述的南亚果实蝇内参基因，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光定量引物的核苷酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：高旭渊，于永浩，翟雨桐，曾宪儒，龙秀珍，何瞻，韦德卫，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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