【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于灭活疫苗领域，具体涉及一种猪支原体肺炎高效灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、猪支原体肺炎(mps)又称地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae，mhp)引起的一种接触性慢性呼吸性传染病。猪肺炎支原体mhp是一种微小的微生物，主要寄生于猪的呼吸道上皮细胞中，通过破坏上皮表面的纤毛影响黏膜清除系统，进而影响呼吸道的免疫系统。mhp一旦感染，其菌株在动物体内会持续存在至少12周，这意味着感染后的动物免疫反应不能迅速将其从呼吸道中清除，因此，mhp还可能使动物容易同时感染其他病原体，包括细菌、寄生虫和病毒等。此外，mhp可以通过直接接触或空气飞沫在猪群之间传播，感染后的猪主要表现为长时间的咳嗽和气喘、呼吸困难、生长迟缓等症状，且这些症状可能会逐渐加重，在严重的情况下，可能导致猪的死亡。这些患病猪剖解时以肺部病变为主，出现“肉变样”或“胰变样”等实质性病变。
2、目前，猪支原体肺炎在世界范围内高度流行，mhp感染主要影响猪的生长和发育，由于不同阶段的猪均能感染猪支原体肺炎，传染性强，感染率高，常常继发其他病原的感染，导致饲料利用率降低，出栏时间延长，给猪业养殖造成非常明显的影响，带来重大经济损失。
3、为了预防和控制猪支原体肺炎，养殖户需要采取一系列的措施。其中，疫苗接种是防治猪支原体肺炎的重要方法。但是，mhp的生长条件相对较为特殊，体外培养条件苛刻，对营养成分的要求较高，需要特定的营养物质来维持其生长和繁殖。然而，目前对于mhp的营养需求了解尚不全面，
4、因此，针对猪支原体肺炎菌种体外培养技术、猪支原体肺炎疫苗的制备技术等进行研究，探索新的mhp疫苗制备技术和策略，具有非常重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术旨在提供一种猪支原体肺炎高效灭活疫苗及其制备方法，针对猪支原体肺炎菌种体外培养技术、猪支原体肺炎疫苗的制备技术等进行改进，制备疫苗的工艺简单且所制备的灭活疫苗免疫动物后免疫效果好，提高了疫苗的质量。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种猪支原体肺炎高效灭活疫苗，所述灭活疫苗为佐剂混合疫苗，由蛋白浓度为200～250μg/ml的灭活猪肺炎支原体菌液与isa76vg佐剂按照1:1～3的体积比混合组成。
4、优选的，所述灭活猪肺炎支原体菌液的培养方法包括：
5、(1)一级种子繁殖：将猪肺炎支原体生产用菌种按5～15％比例接种于含5～15％猪肺浸液的mh液体培养基，30～40℃培养，培养基颜色变黄，ph值降至6.5～7.0时收获菌液，作为一级种子；
6、(2)二级种子繁殖：将一级种子按10～18％比例接种于含5～15％猪肺浸液的mh液体培养基，30～40℃培养，培养基颜色变黄，ph值降至6.5～7.0时收获菌液，作为二级种子；
7、(3)菌液繁殖：将二级种子按10～18％比例接种含5～15％猪肺浸液的mh液体培养基，30～40℃培养，培养基颜色变黄，ph降至6.5～7.0，收获菌液，得到猪肺炎支原体菌液；
8、(4)将猪肺炎支原体菌液进行纯粹检验和活菌滴度测定，然后加入灭活剂进行灭活，检测灭活菌液蛋白浓度，制得灭活猪肺炎支原体菌液。
9、优选的，所述猪肺浸液是通过猪肺组织进行消化制备，具体包括如下步骤：
10、将猪肺组织按照质量体积比为2：20～30料液比添加磷酸盐缓冲液制备匀浆；调节ph至6.0～8.0，加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶各3800～4200u/g，搅拌均匀；放入50～60℃的水浴锅中反应，在10、20、30、90、180、300和360min时及时混匀；置于沸水中灭活8～15min；取出冷却至室温，无菌操作分装至ep管中，2500～3000r/min离心3～8min去除沉淀，吸取上清分装，置于-30～40℃保存。
11、优选的，步骤(4)中所述纯粹检验，包括采用活菌纯粹检验法对猪肺炎支原体菌液进行纯粹检验。
12、优选的，所述活菌纯粹检验法包括：将猪肺炎支原体菌液分别接种8～12％ mh液体培养基和0.1～0.5mlmh固体培养基，35～40℃培养观察8～12日，观察菌液生长情况和菌落形态，同时接种硫乙醇酸盐培养基tg、酪胨琼脂ga和鲜血琼脂斜面培养基各2支，每支0.2ml，1支置35～40℃培养，1支置23～27℃培养；接种葡萄糖蛋白胨汤gp 1支，每支0.2ml，置23～27℃培养，观察4～6日，记录结果。
13、优选的，步骤(4)中所述活菌滴度测定包括：取11支无菌试管，每管装4.5ml含5～15％猪肺浸液的mh液体培养基，在第1管加入0.5ml猪肺炎支原体菌液培养物，混合均匀后取0.5ml加入第2管，如此连续进行10倍系列稀释至10-10，同时设未加菌液的含5～15％猪肺浸液的mh液体培养基为阴性对照，置37±1℃培养12～16日，以培养基ph下降0.5以下最末1管作为菌液的ccu。
14、优选的，步骤(4)中所述灭活剂为浓度为0.5～2.0％的硫柳汞溶液，其终浓度达到0.005～0.02％；加入灭活剂后置2～8℃灭活24小时，期间振摇2次；所述灭活菌液蛋白浓度应≥4.3mg/ml。
15、本专利技术的第二个目的是提供一种如上述猪支原体肺炎高效灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
16、s1、水相的制备：将灭活猪肺炎支原体菌液用缓冲液稀释成蛋白浓度为200～250μg/ml的猪肺炎支原体菌液，制得水相；
17、s2、油相的制备：将76vg佐剂装入灭菌瓶内，120～130℃高压灭菌30～40分钟，冷却后备用，制得油相；
18、s3、乳化：将水相与油相按1:1～3(w/w)比例乳化；
19、s4、将乳化后的疫苗充分摇匀，进行定量分装，加盖密封，即得。
20、优选的，步骤s3中所述乳化过程包括：
21、先将油相加入剪切机内，1200～1800r/min搅拌的同时缓缓加入水相后，以10000～15000r/min搅拌3～10分钟，制得油乳剂灭活疫苗。
22、优选的，所述缓冲液为tris-nacl缓冲液。
23、本专利技术的设计原理或构思：
24、本专利技术提供了一种创新的疫苗制备方法，该方法的核心在于采用了一种独特且优化的培养基，本专利技术采用含5～15％猪肺浸液的mh液体培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗为佐剂混合疫苗，由蛋白浓度为200～250μg/mL的灭活猪肺炎支原体菌液与ISA76VG佐剂按照1:1～3的体积比混合组成。
2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述灭活猪肺炎支原体菌液的培养方法包括：
3.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述猪肺浸液是通过猪肺组织进行消化制备，具体包括如下步骤：
4.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，步骤(4)中所述纯粹检验，包括采用活菌纯粹检验法对猪肺炎支原体菌液进行纯粹检验。
5.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述活菌纯粹检验法包括：将猪肺炎支原体菌液分别接种8～12％MH液体培养基和0.1～0.5mLMH固体培养基，35～40℃培养观察8～12日，观察菌液生长情况和菌落形态，同时接种硫乙醇酸盐培养基TG、酪胨琼脂GA和鲜血琼脂斜面培养基各2支，每支0.2mL，1支置35～40℃培养，1支置23～27℃培养；接种葡萄糖蛋白胨汤GP
6.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，步骤(4)中所述活菌滴度测定包括：取11支无菌试管，每管装4.5mL含5～15％猪肺浸液的MH液体培养基，在第1管加入0.5mL猪肺炎支原体菌液培养物，混合均匀后取0.5mL加入第2管，如此连续进行10倍系列稀释至10-10，同时设未加菌液的含5～15％猪肺浸液的MH液体培养基为阴性对照，置37±1℃培养12～16日，以培养基pH下降0.5以下最末1管作为菌液的CCU。
7.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，步骤(4)中所述灭活剂为浓度为0.5～2.0％的硫柳汞溶液，其终浓度达到0.005～0.02％；加入灭活剂后置2～8℃灭活24小时，期间振摇2次；所述灭活菌液蛋白浓度应≥4.3mg/mL。
8.一种如权利要求1所述猪支原体肺炎高效灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述乳化过程包括：
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-NaCl缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗为佐剂混合疫苗，由蛋白浓度为200～250μg/ml的灭活猪肺炎支原体菌液与isa76vg佐剂按照1:1～3的体积比混合组成。
2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述灭活猪肺炎支原体菌液的培养方法包括：
3.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述猪肺浸液是通过猪肺组织进行消化制备，具体包括如下步骤：
4.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，步骤(4)中所述纯粹检验，包括采用活菌纯粹检验法对猪肺炎支原体菌液进行纯粹检验。
5.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎高效灭活疫苗，其特征在于，所述活菌纯粹检验法包括：将猪肺炎支原体菌液分别接种8～12％mh液体培养基和0.1～0.5mlmh固体培养基，35～40℃培养观察8～12日，观察菌液生长情况和菌落形态，同时接种硫乙醇酸盐培养基tg、酪胨琼脂ga和鲜血琼脂斜面培养基各2支，每支0.2ml，1支置35～40℃培养，1支置23～27℃培养；接种葡萄糖蛋白胨汤gp 1支，每支0.2ml，置23～27℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：严悌昆，黄淑芬，张逸彬，马军，朱炜斌，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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