【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及材料，尤其涉及一种用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台及其制备方法和应用。
技术介绍
1、结直肠癌(crc)是世界上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中排名第三，严重威胁人类生命健康。crc的早期临床症状是隐蔽的，在早期很难发现。大多数患者确诊时已经处于中晚期，错过了手术的最佳时机，术后5年生存率仅为15％。因此，早期发现和治疗对于降低癌症患者的高死亡率和改善预后至关重要。结肠镜检查和成像在临床实践中常用于crc的早期诊断，但不适合于大规模筛查。因此，研究人员基于分子生物学技术探索了许多新的crc生物标志物。先前研究小组发现核不均一核糖核蛋白a1(hnrnpa1)是crc中最显著的改变诱导蛋白之一，其在crc中表达远远高于正常人(121.25±71.78ng/ml)，与crc进展密切相关。此外，还有研究表明通过比较crc患者和正常人体组织，发现s100钙结合蛋白p(s100p)的表达(28.47±44.86ng/ml)也远高于正常人，后续研究也表明s100p与crc的临床分期、淋巴结转移和复发有关。这些证据均提示hnrnpa1和s100p可作为新的血清肿瘤标志物用于crc的早期诊断。
2、目前，已经开发了一系列蛋白质标记物测定方法，如酶联免疫吸附测定(elisa)、化学发光免疫测定和荧光免疫测定。然而，这些方法繁琐且耗时，对样品要求高，不能用于多重分析且价格昂贵。因此，开发一种简便、快速、超灵敏的检测方法仍然是一个挑战。近年来，表面增强拉曼散射
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的主要目的是提供一种用于检测结直肠癌(crc)生物标志物核不均一核糖核蛋白a1(hnrnpa1)和s100钙结合蛋白p(s100p)的微流控(loc)表面增强拉曼散射(sers)平台的制备方法，本专利技术提供的方法灵敏度高、特异性强、组装过程简单、操作简单、便携性强。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的微流控loc表面增强拉曼散射sers平台的制备方法，包括以下步骤：
4、1)将聚苯乙烯(ps)微球模板加热后进行蚀刻，洗涤后得到硅纳米阵列(sinca)；
5、2)在sinca表面溅射au薄膜，得到金硅纳米阵列(aunca)；
6、3)将hnrnpa1的适配体与拉曼信号分子标记的互补单链ssdna1杂交形成双链结构、s100p的适配体与拉曼信号分子标记的互补单链ssdna2杂交形成双链结构，将两种双链结构均修饰到步骤2)制备得到的aunca表面，得到捕获基底；其中，hnrnpa1的适配体与s100p的适配体的5'端均修饰有巯基；
7、4)将步骤3)所得捕获基底嵌入载玻片，通过键合方式，与具有多个微通道的盖板相结合，构建得到loc sers平台。
8、芯片实验室(loc)是一个基于微流体技术的分析化学平台，通过各种微观结构单元(如微米到亚毫米的流体通道、反应或检测室)操纵微米级空间中的流体，使用分析仪器可以自动完成复杂的生化学反应过程。传统的loc平台通常依赖于外部设备，如电源和注射泵，以实现微通道中的自发流体流动。为了克服这种情况，通常引入毛细管泵作为流体驱动元件，以实现自发流动并稳定微通道中的流体流速。本专利技术将sers与loc平台相结合，并引入梳状结构通道作为毛细管泵，使sers测试更加可再生、高效、安全和环保。
9、本专利技术中，如图1所示，提供了一种毛细管泵驱动的多重loc sers平台，结合一步识别释放机制，以有效检测hnrnpa1和s100p。在此之前，创新设计和制造了具有高密度“热点”的致密均匀的金纳米冠阵列(aunca)，以确保广泛增强sers信号。为了满足其要求，在aunca上修饰了在5'端具有巯基的适配体(apt-hnrnp a1和apt-s100p)，并在适配体的互补单链ssdna1和ssdna2的末端标记了cy5和5-fam，用于与它们杂交以制备功能化的aunca；随后，在嵌入检测区域之后获得多路复用的loc sers平台。在靶标存在的情况下，相应的适配体特异性捕获hnrnpa1和s100p，导致ssdna1和ssdna2以从aunca脱落，拉曼信号强度降低。根据这一原理，可以满足hnrnpa1和s100p的快速灵敏检测。此外，在将结果与elisa的结果进行比较后，该loc sers平台在检测临床样本方面的准确性得到了保证。总之，该方法可用于生物标志物的多重检测，在crc早期诊断中具有潜在的应用前景。
10、进一步地，步骤1)中，所述ps微球模板的制备包括以下步骤：
11、将ps微球悬浮液、正己烷与乙醇混合，静置以形成单层薄膜；
12、使用亲水处理的硅片捞出单层薄膜，得到单层的ps微球模板；
13、其中，所述ps微球悬浮液、正己烷与乙醇的混合比为1:1～3:1～2；优选为体积比1:2:1。
14、进一步地，步骤1)中，所述ps微球模板加热的时间为20-40分钟，加热的温度为60-80℃；优选的，将ps微球模板置于75℃烘箱中加热30分钟；
15、所述蚀刻具体为采用离子蚀刻机蚀刻，具体是在200w条件下进行蚀刻；
16、所述洗涤具体为采用乙醇冲洗，洗涤时间100-300秒，优选为180秒；
17、洗涤后还包括包括退火处理。
18、其中，所述退火处理具体为在600℃退火2小时，除去残留物后得到sinca。
19、进一步地，步骤3)中，所述hnrnpa1的适配体的序列如seq id no.1所示；所述s100p的适配体的序列如seq id no.2所示；所述ssdna1的序列如seq id no.3所示；所述ssdna2的序列如seq id no.4所示。
20、进一步地，ssdna1的拉曼信号分子标记为花氰染料(cy5)；所述ssdna2的拉曼信号分子标记为5-羧基荧光素(5-fam)；或者两者交换。
21、进一步地，步骤3)具体包括以下步骤：
22、3.1)将tcep与未修饰前的hnrnpa1和s100p的适配体混合20-40分钟，得到混合液a；
23、3.2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，步骤3)具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoC SERS平台的制备方法，其特征在于，步骤4)具体包括以下步骤：
8.根
9.权利要求1-7任一所述制备方法制备得到的用于检测CRC生物标志物hnRNPA1和S100P的LoCSERS平台的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台的制备方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的用于检测crc生物标志物hnrnpa1和s100p的loc sers平台的制备方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦伟，曹小卫，蒋凤娟，钱亚云，黄永，朱群山，李利毛，李巍，
申请(专利权)人：扬州市江都人民医院扬州大学附属江都人民医院，
类型：发明
国别省市：
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