【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物分子生物学、生物信息学和植物分子育种领域，更具体涉及鉴定垂柳植株性别的dna序列标志物及其检测引物。
技术介绍
1、垂柳是杨柳科柳属的高大落叶乔木，是我国重要的绿化树种，在全国各地广泛种植。我国描述垂柳的诗词非常多，如“四面荷花三面柳，一城山色半城湖”和“风吹杨柳细腰枝，袅袅婷婷荡绿池”等，都体现着垂柳在我国重要的历史地位和文化价值。垂柳是雌雄异株植物，雌株每年5月前后果序成熟时会产生大量柳絮，柳絮包含白色短毛和种子会危害城市居民的健康，聚集的柳絮易燃容易引发火灾，是城市管理不可忽略的问题。目前鉴定垂柳性别有两种形式，一种是利用同工酶；另一种是在花期时对花序、解剖结构和结果情况等方面进行观察。除此之外很难从形态上准确判断植株性别。
2、在苗期鉴定出植株的性别，根据生产目的对性别比例进行合适的控制，对垂柳育种及栽培均具有重要的意义。因此，开发快速、准确且节约成本的方法来对垂柳植株性别进行鉴定对育种和种植都尤为重要。利用与性别连锁的分子标记能够克服形态和生理生化指标受环境及发育阶段影响的缺点，从分子水平上在苗期鉴定出植株的性别。根据特异性分子标记设计的pcr引物具有高效、稳定和使用范围广等特点。然而，垂柳性别相关的特异性分子标记至今未见相关报道。
技术实现思路
1、鉴于此，为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供用于鉴定垂柳性别的dna序列标志物及其检测引物，能够快速地将雄性和雌性垂柳植株区分开来，操作简单，重复性好，准确度高。
2
3、通过对垂柳的雌雄株各20个个体进行重测序，计算每个个体的k-mer(k＝31),将雌雄株的k-mers回贴到新组装的垂柳的雌株单倍型基因组上，统计显著富集性别特异性k-mer的区域，确定了15ba染色体上的5.3至9.7mb为性别特异性区域，将区域内的基因在整个基因组上(除特异性区域外)进行blastp分析，无搜索结果的且长度在500-1000bp的基因被选为雌性植株特异性dna序列，最终得到长度为682bp的性别特异性的核苷酸序列sabab15bg0046700(雄株植株中无该基因的同源序列)，通过对该特异性片段的检测，能够对垂柳植株的性别实现准确的鉴定。
4、本专利技术提供的垂柳雌性植株特异性dna序列标志物，其核苷酸序列片段如seq idno.1所示：
5、agatatatgaaggtgcggtctgtattcaccaagggaagacctatatggtcaaggaattggatatatcagaaaagatag
6、ctttgtgctatgaagccaacttgtattactatacaaaaacccgtgattatacagatattgaattagcaaaaattgcat
7、gcttttgttatgcagcagctagttaattacatggttgccatgcagaatatatatatatatgtggttgttgagtctgaa
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9、attggtggggaatgcaaagaggagaaacatgtgggataggctgctgagtatcatgttattatgaatgtatacaatata
10、gcaattgtcacaatgctaagaagaaacattactatattctcttaatggcatttgcagtttaatgtgattccctttgaa
11、gatggaattatgacatttccagtaacttcttgtcctgcaatcatctaggtatccaccaagggccttcaagagccagtc
12、ttcaagaacaactgctcaagaactttcttgtaaagtaacatctacttggtttggtttctattgcatacaaagaggaagcaacaaagtcttggatacttttgatctttcactacccaaatattcacatggatcttag(seq idno.1)
13、本专利技术还提供了鉴定垂柳植株性别，通过检测本专利技术所述dna序列标志物而实现，其是下述p1引物对、p2引物对或p3引物对。
14、p1引物对：
15、正向引物f(seq id no.2)：5'atatgaaggtgcggtctgtatt 3'
16、反向引物r(seq id no.3)：5'gttcttgagcagttgttcttga3'；
17、p2引物对：
18、正向引物f(seq id no.4)：5'tgaaggtgcggtctgtatt 3'，
19、反向引物r(seq id no.5)：5'cttgagcagttgttcttgaag 3'；
20、p3引物对：
21、正向引物f(seq id no.6)：5'aaggtgcggtctgtattca 3'，
22、反向引物r(seq id no.7)：5'gttcttgagcagttgttcttg 3'；
23、本专利技术还提供了一种鉴定垂柳性别的试剂盒，其包括本专利技术所述的引物对中任意一对。
24、本专利技术所述的试剂盒中，还包括用于pcr反应的试剂，例如taq酶，缓冲液、纯净水，以及样品处理液等。
25、本专利技术提供一种鉴定垂柳性别的方法，其包括：
26、以待测垂柳样品的全基因组dna作为模版，采用本专利技术所述的引物组中的任意一对进行pcr扩增，根据扩增产物判断垂柳性别。
27、本专利技术所述鉴定垂柳样品性别的方法中，所述判断包括：
28、pcr扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳检测的结果获得一条特异性条带，则表明该样品为雌(其中以p1为引物对时，扩增的特异性条带长度为565bp；p2为引物对时，长度为559bp；p3为引物对时，长度为560bp)，若未获得相应的条带，则样品为雄。
29、本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过筛选与垂柳性别连锁的特异性dna序列，得到垂柳雌特异性的dna序列标志物，并设计得到3组检测引物对。本专利技术提供的dna序列标志物及其检测引物可将垂柳雄性植株和雌性植株准确区分开，操作简单、重现性好、准确度高，有效克服了在选育期和植株非花期难以区分垂柳雄株和雌株的缺点。可在育种期间对目标性别进行筛选，节省生产和管理成本；该专利技术在垂柳性别鉴定在生产实践中有十分广阔的应用前景。
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1.一种垂柳雌性植株的特异性DNA序列标志物，其特征在于，其核苷酸序列片段如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的DNA序列标志物在鉴定垂柳植株性别中的应用。
3.一种用鉴定垂柳植株性别的检测引物，其特征在于，其为P1引物对，正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；或者其为P2引物对，正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；或者其为p3引物对，正向引物序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物序列如SEQ ID NO.7所示。
4.一种用于鉴定垂柳性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物中任意一对检测引物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR反应的试剂，例如Taq酶，缓冲液、纯净水，以及样品处理液等。
6.一种鉴定垂柳性别的方法，其特征在于，以待测垂柳样品的全基因组DNA作为模版，采用权利要求2所述的引物中的任意一对检测引物进行PCR扩增，根据扩增产物判断垂柳性别。
7.如权利
8.如权利要求7所述的鉴定垂柳性别的方法，其特征在于，通过在琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增产物，通过是否存在相应的扩增产物条带来判断检测垂柳样品是雌株还是雄株。
9.如权利要求7所述的鉴定垂柳性别的方法，其特征在于，其中扩增的PCR反应液组成，以20ul体积计，含有如下成分：
10.如权利要求9所述的鉴定垂柳性别的方法，其特征在于，其PCR反应条件如下：
...【技术特征摘要】
1.一种垂柳雌性植株的特异性dna序列标志物，其特征在于，其核苷酸序列片段如seqid no.1所示。
2.如权利要求1所述的dna序列标志物在鉴定垂柳植株性别中的应用。
3.一种用鉴定垂柳植株性别的检测引物，其特征在于，其为p1引物对，正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示；或者其为p2引物对，正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示；或者其为p3引物对，正向引物序列如seq id no.6所示，反向引物序列如seq id no.7所示。
4.一种用于鉴定垂柳性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物中任意一对检测引物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于pcr反应的试剂，例如taq酶，缓冲液、纯净水...
【专利技术属性】
技术研发人员：何理，龚广南，王苑，王红霞，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：
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