【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多肽制备和应用，具体涉及一种抗凝血地龙多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
1、现代药理研究表明，动物类中药发挥作用的主要为小肽类成分，这些小肽成分具有独特的生物活性和较低的分子量，能够通过调节细胞信号通路、影响酶活性以及免疫调节等多种机制，在治疗多种疾病中展现出显著疗效。随着科学研究的不断深入，小肽类成分的药理作用和作用机制逐渐明晰，为动物类中药的现代化研究和临床应用提供了新的思路和方向。
2、地龙为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓的干燥体，为我国传统中药之一，具有抗凝、促纤溶、改善血液循环等作用。临床上，地龙提取液在体外有很好的抗凝效果，抑制血栓形成，主要用于防治脑缺血性疾病、心血管疾病等。虽然既往研究显示了地龙良好的抗凝作用，但是对其抗凝血活性物质分子大小、结构等方面的研究还不够深入。因此，深入研究地龙抗凝的有效成分，不仅有助于揭示地龙药效的分子机制，还能为开发新型抗凝药物提供科学依据。
技术实现思路
1、为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种抗凝血地龙多肽及其制备方法和应用，所述地龙多肽表现出强抗凝血活性。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种抗凝血地龙多肽，所述地龙多肽的氨基酸序列为iisnfqar，如seq id no.1所示；所述地龙多肽的分子结构为：
4、。
5、上述地龙多肽采用以下步骤进行制备：
6、（1）将地龙粉碎过筛，加水，加热煮
7、（2）将步骤（1）得到的混合溶液冷却后，调节ph值，酶解，煮沸后，分离纯化；
8、（3）将步骤（2）得到的纯化样品处理后进行lc-tof-ms分析，得到活性肽结构为iisnfqar。
9、进一步地，步骤（2）中，所述酶解的方法为：混合溶液加热煮沸后，冷至约35～45℃，调节ph至1.0～3.0，加入0.5～2%胃蛋白酶，30-40℃酶解1-2 h，调节ph至7.0～9.0，加入0.5～2%胰蛋白酶，保温3～5 h，煮沸10～15 min；所述分离纯化为3500～4500 rpm离心15～20 min，上清液通过3 kd超滤膜超滤，电渗析或透析袋脱盐后，进行阳离子树脂和rp-hplc半制备分离纯化。
10、进一步地，步骤（3）所述的lc-tof-ms分析的纳升液相色谱分析柱条件：c18反相分析柱75 mm×20 cm×3 µm；流动相a：99.9%水和0.1%甲酸混合液，流动相b：80%乙腈和0.1%甲酸混合液；液相梯度洗脱为：0-2 min，2-6% b；2-95 min，6-20% b；95-107 min，20-32%b；107-108 min，32-100% b；108-120 min，100% b；流动相流速为300 nl/min。
11、进一步地，步骤（3）中，所述将步骤（2）得到的纯化样品处理的方法为：取1～5 mg步骤（2）纯化后的样品加入200 µl 25 mm碳酸氢铵溶液溶解，加入2 µl 1m的dtt 60℃水浴放置>40 min，再加入8 µl新鲜配置的1 m碘乙酰胺，室温避光放置30 min；脱盐处理，干燥后的样品加入10 µl上样缓冲液振荡溶解。
12、进一步地，步骤（1）中，所述地龙粉碎过筛标准目数为80目；加水的重量为地龙重量的8～12倍；所述加热煮沸时间为15～30 min。
13、一种上述地龙多肽的应用，所述地龙多肽用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物。
14、进一步地，将多肽或其衍生物或组合物作为活性成分直接或与药用载体组合制成制剂。
15、进一步地，所述制剂为注射剂、片剂、胶囊、气雾剂或滴剂。
16、有益效果：（1）本专利技术所述的多肽结构是地龙仿生酶解小分子肽类经精制纯化并经分析得到的高含量、高活性的小分子生物活性肽成分，此种小分子生物活性肽成分为首次发现，未见有关报道。
17、（2）本专利技术对所述地龙多肽iisnfqar研究证实了预防和治疗血栓性疾病的药用价值，为临床应用地龙多肽iisnfqar治疗血栓性提供了坚实的基础，为动物药活性肽物质的开发提供了数据支持。
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1.一种抗凝血地龙多肽，其特征在于，所述地龙多肽的氨基酸序列为IISNFQAR；所述地龙多肽的分子结构为：
2.一种权利要求1所述抗凝血地龙多肽的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酶解的方法为：混合溶液加热煮沸后，冷却至35～45℃，调节pH至1.0～3.0，加入0.5～2%胃蛋白酶，30～40℃酶解1-2 h，调节pH至7.0～9.0，加入0.5～2%胰蛋白酶，保温3～5 h，煮沸10～15 min。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离纯化采用3500～4500 rpm离心15～20 min，上清液电渗析或透析袋脱盐后，通过3000 Da超滤膜超滤，进行阳离子树脂和RP-HPLC半制备分离纯化。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的LC-TOF-MS分析采用纳升液相色谱分析柱；条件为：C18反相分析柱75 mm×20 cm×3µm；流动相A：99.9%水和0.1%甲酸混合液，流动相B：80%乙腈
6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述将步骤（2）得到的纯化样品处理的方法为：取1～5 mg步骤（2）纯化后的样品加入200 µL 25 mM碳酸氢铵溶液溶解，加入2 µL 1 M的DTT60℃水浴放置>40 min，再加入8 µL新鲜配置的1 M碘乙酰胺，室温避光放置30 min；脱盐处理，干燥后的样品加入10 µL上样缓冲液振荡溶解。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述地龙粉碎过筛的标准目数为80目；所述加水的重量为地龙重量的8～12倍；所述加热煮沸时间为15～30 min。
8.一种权利要求1所述抗凝血地龙多肽的应用，其特征在于，所述地龙多肽用于制备治疗血栓性疾病的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将多肽或其衍生物或组合物作为活性成分直接或与药用载体组合制成制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制剂为注射剂、片剂、胶囊、气雾剂或滴剂。
...【技术特征摘要】
1.一种抗凝血地龙多肽，其特征在于，所述地龙多肽的氨基酸序列为iisnfqar；所述地龙多肽的分子结构为：
2.一种权利要求1所述抗凝血地龙多肽的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酶解的方法为：混合溶液加热煮沸后，冷却至35～45℃，调节ph至1.0～3.0，加入0.5～2%胃蛋白酶，30～40℃酶解1-2 h，调节ph至7.0～9.0，加入0.5～2%胰蛋白酶，保温3～5 h，煮沸10～15 min。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离纯化采用3500～4500 rpm离心15～20 min，上清液电渗析或透析袋脱盐后，通过3000 da超滤膜超滤，进行阳离子树脂和rp-hplc半制备分离纯化。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的lc-tof-ms分析采用纳升液相色谱分析柱；条件为：c18反相分析柱75 mm×20 cm×3µm；流动相a：99.9%水和0.1%甲酸混合液，流动相b：80%乙腈和 0.1%甲酸混合液；液相梯度洗脱为：0-2 min，2-6%b；2-95 min，6...
【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，李亚男，徐天任，于小钧，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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