【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品、医药，具体提供了一种利用解脂耶氏酵母将白藜芦醇生物转化为紫檀芪的技术，具体涉及利用解脂耶氏酵母将白藜芦醇生物转化为紫檀芪的方法。
技术介绍
1、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母，属于半子囊菌类(hemiascomycetes)。之所以称之为非常规酵母，是因为其与酿酒酵母等常规酵母相比，在生理特征、代谢途径、基因表达上表现出许多特性，比如解脂耶氏酵母有很强的分解疏水化合物的能力，只能利用葡萄糖、甘油、醋酸盐以及乙酰氨基葡萄糖苷为碳源进行生长。作为一种公认(gras)的安全生物体，解脂耶氏酵母正在成为代谢工程及合成生物学领域中一种至关重要的新型非模式微生物底盘细胞，与大肠杆菌相比，解脂耶氏酵母具有完整的内膜系统和与植物相类似的蛋白质翻译后修饰系统，更适合植物源蛋白质的表达；除此之外，与大肠杆菌和酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母属于典型的产油酵母，细胞内脂肪酸(fattyacid)、脂酰辅酶a(fattyacyl-coa)以及乙酰辅酶a(acetyl-coa)的积累量较高。因此，该酵母在生产植物萜类化合物(乙酰辅酶a衍生物，acetyl-coaderivedproducts)方面具有明显优势，发展前景广阔，并已通过基因工程用于生产一系列高价值萜类化合物，如β-胡萝卜素，α-法尼烯、香叶醇。
2、紫檀芪是(3,5-dimethoxy-4'-hydroxy-trans-stilbene，pterostilbene)二苯乙烯的代表物质，是一种天然衍生化合物，表现出强大的抗真菌活
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种利用解脂耶氏酵母将白藜芦醇生物转化为紫檀芪的技术，使用解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)作为底盘细胞，通过基因工程手段表达白藜芦醇o-甲基转移酶(romt)，实现了白藜芦醇到紫檀芪的生物转化，相比化学合成或直接从天然植物中提取紫檀芪更为高效和环保。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供一种合成紫檀芪的生物转化方法，包括：
4、将重组质粒转入底盘菌株，经培养筛选获得重组解脂耶氏酵母；
5、通过重组解脂耶氏酵母在基础培养基中发酵将白藜芦醇生物转化为紫檀芪。
6、进一步地，重组解脂耶氏酵母的底盘菌株为yarrowia lipolytica po1f或yarrowia lipolytica po1g，重组质粒为pacycduet-romt。
7、进一步地，重组解脂耶氏酵母的底盘菌株为yarrowia lipolytica po1f。
8、进一步地，所述重组质粒pacycduet-romt是携带如seq id no:1所示序列基因的线性化载体pacycduet。
9、进一步地，所述发酵条件为在25～35℃下进行，持续100～150h，发酵过程ph值保持在4.5～5.5左右，同时通过控制搅拌和通风将溶解氧保持在5～20％、c/n保持在(5～15):1。
10、进一步地，所述发酵条件为在30℃下进行，持续120h，发酵过程ph值保持在5.0左右，同时通过控制搅拌和通风将溶解氧保持在10％、c/n保持在10:1。
11、进一步地，所述基础培养基包含0.5～1.5mm白藜芦醇、0.4～0.8g/l镁盐(例如，mgcl2或mgso4·7h2o)、8～12g/l氮源(例如，胰蛋白胨、(nh4)2so4)、3～7g/l钾盐(例如，kh2po4、k2so4)、30～50g/l碳源(例如，甘油、蔗糖、葡萄糖、可溶性玉米淀粉)、5～10mg/l维生素(例如，wolfe's vitamin solution)及1-3mg/l微量金属溶液。
12、镁盐选自：mgcl2、mgso4·7h2o等。
13、氮源选自：胰蛋白胨、(nh4)2so4等。
14、钾盐选自：kh2po4、k2so4等。
15、碳源选自：甘油、蔗糖、葡萄糖、可溶性玉米淀粉等。
16、维生素：wolfe's vitamin solution等。
17、微量金属溶液：由1.43g/l znso4·7h2o、0.32g/l mncl2·4h2o、0.23g/lcocl2·6h2o、0.12g/l na2moo4·2h2o、2.8g/l feso4·7h2o、80ml 0.5m edta构成。
18、wolfe's vitamin solution配方与配制方法：使用1l去离子水重悬以下成分，搅拌使其完全溶解，经过0.22μm滤膜过滤除菌。
19、
20、进一步地，所述基础培养基包含0.5～1.5mm白藜芦醇、0.4～0.8g/l mgso4·7h2o、8～12g/l(nh4)2so4、3～7g/l kh2po4、30～50g/l葡萄糖、5～10mg/l维生素及1-3mg/l微量金属溶液。
21、进一步地，所述基础培养基包含1mm白藜芦醇、0.6g/l mgso4·7h2o、10g/l(nh4)2so4、5g/l kh2po4、40g/l葡萄糖、8mg/l维生素及1-3mg/l微量金属溶液。
22、进一步地，获得所述重组解脂耶氏酵母的步骤，包括：
23、构建载体：将白藜芦醇o-甲基转移酶基因(romt)片段与大肠杆菌表达载体进行组装后经消化、转化后扩大培养得到重组质粒pacycduet-romt；
24、转化：将重组质粒pacycduet-romt转入解脂耶氏酵母，经培养筛选获得重组解脂耶氏酵母。
25、进一步地，所述大肠杆菌表达载体为线性载体pacycduet。
26、进一步地，所述组装过程为：使用2x multif seamless assembly mix将目的基因romt与线性化载体pacycduet进行组装；优选地，所述组装的反应体系为线性化载体pacycduet 1～3μl、romt片段2～4μl、2x multif sea本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述发酵条件为在25～35℃下进行，持续100～150h，发酵过程pH值保持在4.5～5.5左右，同时通过控制搅拌和通风将溶解氧保持在5～20％、C/N保持在(5～15):1。
3.根据权利要求1所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述基础培养基包含0.5～1.5mM白藜芦醇、0.4～0.8g/L镁盐(例如，MgCl2或MgSO4·7H2O)、8～12g/L氮源(例如，胰蛋白胨、(NH4)2SO4)、3～7g/L钾盐(例如，KH2PO4、K2SO4)、30～50g/L碳源(例如，甘油、蔗糖、葡萄糖、可溶性玉米淀粉)、5～10mg/L维生素(例如，Wolfe's Vitamin Solution)及1-3mg/L微量金属溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，获得所述重组解脂耶氏酵母的步骤，包括：
5.根据权利要求4所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为
6.根据权利要求5所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述组装过程为：使用2X MultiF Seamless Assembly Mix将目的基因ROMT与线性化载体pACYCDuet进行组装；优选地，所述组装的反应体系为线性化载体pACYCDuet 1～3μL、ROMT片段2～4μL、2XMultiF SeamlessAssembly Mix 4～6μL，45～55℃反应条件组装10～20min；
7.根据权利要求4所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述转化过程中，培养条件为25～35℃、150～300rpm，OD600＝0.8～1.0时，以1％的接种量接种于含有200～300mL YPD液体培养基的1L摇瓶中，在25～35℃、150～300rpm条件下培养24～36h；优选地，所述YPD液体培养基，具体组成为Tryptone 15～30g/L、Yeast Extract 7～15g/L、Glucose15～30g/L。
8.一种重组解脂耶氏酵母，其特征在于，能单独表达白藜芦醇O-甲基转移酶的。
9.根据权利要求8所述重组解脂耶氏酵母，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母携带重组质粒pACYCDuet-ROMT，优选地，所述重组质粒pACYCDuet-ROMT是携带如SEQ ID NO:1所示序列基因的线性化载体pACYCDuet。
10.一种权利要求8-9任一项所述重组解脂耶氏酵母在紫檀芪生产过程中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述发酵条件为在25～35℃下进行，持续100～150h，发酵过程ph值保持在4.5～5.5左右，同时通过控制搅拌和通风将溶解氧保持在5～20％、c/n保持在(5～15):1。
3.根据权利要求1所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述基础培养基包含0.5～1.5mm白藜芦醇、0.4～0.8g/l镁盐(例如，mgcl2或mgso4·7h2o)、8～12g/l氮源(例如，胰蛋白胨、(nh4)2so4)、3～7g/l钾盐(例如，kh2po4、k2so4)、30～50g/l碳源(例如，甘油、蔗糖、葡萄糖、可溶性玉米淀粉)、5～10mg/l维生素(例如，wolfe's vitamin solution)及1-3mg/l微量金属溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，获得所述重组解脂耶氏酵母的步骤，包括：
5.根据权利要求4所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为线性载体pacycduet。
6.根据权利要求5所述制备紫檀芪的生物转化方法，其特征在于，所述组装过程为：使用2x multif seamless asse...
【专利技术属性】
技术研发人员：王安宁，罗彬彬，李安章，侯森，童梦西，
申请(专利权)人：广州梵之容化妆品有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。