【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于在大肠杆菌中表达crm197蛋白并将所述crm197蛋白分泌到周质中的信号序列及其用途，并且更具体地涉及用于表达crm197蛋白的信号序列、编码所述信号序列的核酸、包含所述核酸和crm197蛋白基因的核酸构建体或表达载体、引入了所述核酸构建体或表达载体的重组微生物、以及包括培养所述重组微生物的产生所述crm197蛋白的方法。
技术介绍
1、白喉毒素(dt)是一种蛋白质外毒素，并且由白喉棒状杆菌的致病菌株分泌。白喉毒素是adp-核糖基化酶，其作为由535个残基构成的酶原被分泌并通过用胰蛋白酶样蛋白酶处理分离成两个片段(片段a和b)。片段a是催化活性区域并且是nad依赖性adp-核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白质合成因子ef-2，由此在细胞中灭活ef-2和中断蛋白质合成。
2、crm197是通过分离白喉毒素的各种无毒形式和部分有毒的免疫交叉反应形式(crm或交叉反应物质)发现的(uchida等人,journal of biological chemistry 248,3845-3850,1973)。优选地，crm可具有预定的大小和包含全部或部分dt的组合物。
3、crm197是白喉毒素的酶促高度无活性且无毒的形式，其含有单一氨基酸取代(g52e)。该突变赋予位于nad结合位点前面的活性位点环的内在柔性，从而降低crm197与nad的结合亲和力并去除dt的毒性(malito等人,proc.natl.acad.sci.usa 109(14):5229-342012)。crm197，如dt一样，具有
4、除非化学连接到蛋白质，否则许多抗原具有低免疫原性，尤其是在婴儿和幼儿中，因此将这些抗原生产为缀合物或缀合疫苗。在这些缀合物疫苗中，蛋白质组分也称为“载体蛋白”。crm197通常用作蛋白质-碳水化合物缀合物和半抗原-蛋白质缀合物中的载体蛋白。crm197作为载体蛋白质，具有优于白喉类毒素以及其他类毒素蛋白的若干优点(shinefield vaccine,28:4335,2010)。
5、制备白喉毒素(dt)的方法是本领域熟知的。例如，可以通过从白喉棒状杆菌的培养物中纯化毒素、然后进行化学脱毒，或通过纯化毒素的重组类似物或遗传脱毒类似物来产生dt。
6、蛋白质的丰度使其不可能实现用于疫苗的诸如crm197等白喉毒素的大规模生产。此问题先前已通过在大肠杆菌中表达crm197而得以解决(bishai,等人,j.bacteriol.169:5140-5151)，并且bishai等人已报道了含有毒素的重组融合蛋白(包括tox信号序列)，从而产生降解的蛋白质。
7、与细胞质产生相比，周质中细菌毒素的产生的特征在于，i)蛋白质在切割信号肽后以成熟形式产生，或ii)大肠杆菌的周质是允许形成二硫键的氧化环境，可以有助于产生适当折叠的可溶性蛋白质，iii)与细胞质相比大肠杆菌的周质含有更少的蛋白酶，这有助于避免所表达蛋白质的蛋白水解切割，以及iv)周质还含有更少蛋白质，这允许以更高的纯度获得重组蛋白。
8、通常，蛋白质上的信号序列的存在有利于将蛋白质转运(原核宿主)或分泌(真核宿主)到周质中。在原核宿主中，信号序列使新形成的蛋白质坐落到跨内膜的周质中，然后信号序列被切割。也就是说，重要的是要寻找能够更高效地大规模产生商业基本蛋白质的信号序列，并且有必要开发重组微生物。
9、因此，由于开发以高效且有成本效益的方式产生crm197蛋白的方法的大量努力，诸位专利技术人选择特定信号序列，通过结合密码子背景与二级结构来设计核苷酸序列以优化在大肠杆菌中的翻译，优化编码crm197蛋白的crm197核苷酸序列在大肠杆菌中的表达，并且发现在使用这些时在不改变ph的情况下crm197在大肠杆菌中高效地表达并且高效地分泌到周质中，由此完成了本专利技术。
10、此
技术介绍
章节中公开的信息仅为更好理解本专利技术背景而提供，并且因此所述信息可能不包括形成对本领域技术人员而言已经清楚的现有技术的信息。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是提供一种用于表达具有特定序列的crm197蛋白的信号序列；编码信号序列的核酸；以及使用所述核酸产生crm197蛋白的方法，以通过将crm197蛋白分泌到大肠杆菌的周质中使得crm197蛋白的表达最大化同时使得crm197蛋白对大肠杆菌的毒性最小化。
2、为了实现所述目的，本专利技术提供了一种用于表达crm197蛋白的信号序列，所述信号序列由seq id no:13至seq id no:21的氨基酸序列中的任一个表示。
3、本专利技术还提供了一种编码用于表达所述crm197蛋白的信号序列的核酸。
4、本专利技术还提供了一种包含所述核酸和所述crm197蛋白的基因的核酸构建体或表达载体，一种引入了所述核酸构建体或表达载体的重组微生物，以及一种包括培养所述重组微生物的产生crm197蛋白的方法。
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1.一种核酸，所述核酸编码用于表达CRM197蛋白的信号肽，其中所述核酸由SEQ IDNO:6的核苷酸序列表示。
2.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的核酸和所述CRM197蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中所述CRM197蛋白的基因由SEQ ID NO:2的核苷酸序列表示。
4.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1所述的核酸和所述CRM197蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述CRM197蛋白的基因由SEQ ID NO:2的核苷酸序列表示。
6.根据权利要求4所述的表达载体，所述表达载体还包含Trc启动子。
7.一种重组微生物，所述重组微生物中引入了根据权利要求2所述的核酸构建体或根据权利要求4所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组微生物，其中所述重组微生物是大肠杆菌。
9.一种产生CRM197蛋白的方法，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述步骤(b)包括回收分泌到周质中的CR
...【技术特征摘要】
1.一种核酸，所述核酸编码用于表达crm197蛋白的信号肽，其中所述核酸由seq idno:6的核苷酸序列表示。
2.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据权利要求1所述的核酸和所述crm197蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中所述crm197蛋白的基因由seq id no:2的核苷酸序列表示。
4.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求1所述的核酸和所述crm197蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述crm...
【专利技术属性】
技术研发人员：金政贤，HD·金，EH·朴，姜正贤，潘在龟，金义中，C·李，M·朴，
申请(专利权)人：杰诺福克斯公司，
类型：发明
国别省市：
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